蛋白质组学答案终稿(10)

山师限选课答案

优点：

（1）能检测微弱的相互作用

（2）能检测到动态过程不同发育阶段与不同蛋白质的瞬时相互作用

（3）通过能穿膜的交联剂。交联可在体内进行

缺点：没有选择性

2，荧光双向差异凝胶电泳

一般将能在可见光范围内强烈吸收和辐射出荧光的染料称为荧光染料。荧光染料实质上是颗粒很细的荧光染料的树脂固体溶液，这些染料有特定的π电子共轨体系。荧光双向差异凝胶电泳是在双向电泳的基础上出现的技术，将待比较的蛋白质样品经不同的荧光染料标记后，等量混合进行双向电泳。

因荧光染料灵敏度高，所需样品量非常少，每次只需50ug.一张胶可同时分析3个样品，省

去了不同胶图之间的匹配问题，节约时间，重复性提高。

还可以对大样本量进行统计分析，需在每张胶中加入由所有样品等量混合而成的内标，以

确保各张胶之间对比的准确性，以最大限度反映生物学改变而不是系统改变。由于所需的胶数减少，分析通量得到了提高。

（2）细胞培养条件下稳定同位素标签技术（stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC）

培养条件下稳定同位素标签技术，是通过细胞的正常生长代谢，把稳定同位素标记的氨基酸引入到蛋白质组成中，质谱分析质量相差6u。这可以大大简化质谱定量分析前人工处理的复杂度。目前，可用在培养条件下稳定同位素标签技术上的稳定同位素主要包括：2H、13C、15N等。

除了在定量比较蛋白质组研究方面发挥作用外，在生化代谢、信号通路以及蛋白质间相互作用动力学研究等方面也有巨大的潜力。

缺点：只能用在基于培养的细胞体系以及单细胞生物上。

1.同位素标记亲和标签技术的原理

同位素标记亲和标签试剂由3部分组成：①试剂与蛋白质反应的基团，这个基团特异结合肽链中半胱氨酸残基的巯基；②中间的连接子，可以结合稳定的同位素；③亲和标签-生物素，可以和卵白素结合，选择分离同位素标记亲和标签标记的多肽。由8个氘原子与8个氢原子分别ICAT质量正好相差8u。

（1）优点

①兼容任何生长条件下的组织中的蛋白质，比较两种或更多种来源密切相关的蛋白质样品，可以得到不同状态下蛋白质表达量的变化比例。

②烷基化反应高度特异。

③只分离含有半胱氨酸的肽段，降低了体系的复杂性。

④因为分离是在肽段水平上进行的，所以膜蛋白溶解性的问题得到解决，可以对膜蛋白进行鉴定和定量。

⑤因为同位素标记亲和标签技术建立在色谱分离的基础上，任何促进蛋白质溶解的试剂均可使用。 ⑥能够直接鉴定和测量低丰度蛋白质。

（2）缺点

①这一方法无法分析不含半胱氨酸的蛋白质；

②同位素标记亲和标签标记（-500u）在整个质谱分析过程中保留在每个肽上，会影响肽段的检测和增加数据库搜索算法的复杂性，对一些小的片段（小于7个氨基酸残基）更是如此，而对其二级质谱碎片离子解析增加了难度；

③被标记的2个多肽质量相差8u、含有2个半胱氨酸的多肽质量相差16u时与氧化很难区分，对定量和鉴定都带来困难；

④一般同位素标记亲和标签定量的误差在20%以内，但如果样品成分复杂，定量误差会增大，并往往需要手工检测结果；

⑤这种方法要获得完整的信息，最重要的是标记必须是特异、完全的，但当前标记的效率是时间依赖性的，很少能达到80%以上。

另外商品化试剂价位高，影响了应用。

由Gygi等首先发明了同位素标记亲和标签技术（isotope-coded affinity tag, ICAT）， 此技