时间分辨荧光免疫分析技术及临床应用

3,3′2七氟24′,6′2己二酮26′2基)2氯磺酰2邻三联苯(BHHCT),可以作为标记物直接固相检测,已用固相TRFI A法测定甲胎蛋白(AFP)、IgE、促甲状腺激素(TSH)等,其灵敏度有极大提高[3,4]。Wu等[5,6]在Y uan工作的基础上合成两种新螯合物,其中一种已用于T

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的检测。国内潘利华等[7]利用自建的分析方法,在一定条件下使BCPDA与铕离子形成稳定的BCP2 D A2Eu3+2(H BsAb)IgG标记物,测定了标记过程的有关参数,并对标记物的某些光学特性进行了研究。赵吉力等[8]成功地制备时间分辨荧光免疫分析双功能螯合剂BCPDA,并建立Eu3+2BCPDA2蛋白质标记物中蛋白质浓度的测定方法。

表1　一些荧光物质的荧光寿命ns(纳秒)

荧光物质荧光寿命

非特异荧光背景1～10

人血清白蛋白 4.1

球蛋白 3.0

细胞色素C 3.5

异硫氰酸荧光素 4.5

丹磺酰氯14

稀土螯合物103～106

2.1.3　增强溶液　TRFI A主要是解离增强镧系免疫分析技术(diss ociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay,DE LFI A)之所以具有极高的检出灵敏度,主要原因除测量仪器外,荧光增强效力是一个十分重要的因素。免疫反应后所形成的复合物,在弱碱性缓冲液中经紫外光激发所产生的荧光信号甚弱,这主要是因为水是稀土离子经紫外光激发所产生荧光的淬灭剂。所以要加入一种增强液。增强液一般由β2二酮体、三辛基氧化磷(T OPO)、T ritonX2100、醋酸和邻苯二甲酸氢钾(pH2.0～

3.2)组成。酸性增强液使铕离子从螯合物中解离下来,游离的Eu3+在三辛基氧化磷协同下,重新与β2二酮体形成一种新的能够高效率地接受激发光的螯合物。在激发光激发下,铕离子获能,经过电子跃迁并返回基态,可发射极强的荧光信号。目前,增强液中使用的β2二酮体类螯合剂效果最佳的是β2萘甲酰三氟丙酮(β2NT A),其灵敏度可达16×10-18m ol。以β2NT A为例,说明增强液的原理。增强液中T ritonX2100非离子型的表面活性剂可以有效地将Eu3+(β2NT A)3(T OPO)2复合物形成大分子的微囊,微囊的内侧为疏水性基团能有效地溶解脂溶性的β2NT A,外层为亲水性基团,可以和水分子结合。这种微囊可最大限度的将能量传递给Eu3+,从而阻断了β2NT A 吸收能量传递给水所产生的淬灭效应。其中β2二酮体起关键作用,三辛基氧化磷是一种荧光增强协同剂。在多标记测定中,引入了共用荧光增强液主要是在原有的β2二酮体系统中加入了少量稀土离子Y3+、Tb3+或G d3+,从而使系统的荧光强度大大增强。

2.2　基本技术

2.2.1　包被技术　TRFI A包被技术,是保持其灵敏度重要因素,因此在包被抗体之前,往往要对抗体进行纯化,以提高抗体的包被量和均一性。国内外最早的使用的包被的缓冲体系为pH9.6的碳酸盐缓冲液,90年代后改为柠檬酸缓冲液,pH 为4.5,效果明显优于碳酸盐缓冲系统。包被抗体前,将聚苯乙烯微量滴定条先在室温下用0.25%戊二醛处理20min,能够显著提高抗体包被量,增大标准曲线范围,在包被甾体激素2蛋白质结合物时,不必进行封闭,直接加入无水乙醇固定,蛋白虽然变性凝固但牢固的结合在孔内,而连接到蛋白上的甾体激素免疫活性没有改变,可以长期保存。

2.2.2　标记技术　①抗原或抗体标记时,铕离子首先要作为标记物标记到抗原或抗体上。标记时不同蛋白质的反应性依赖于蛋白表面的游离氨基酸数目和蛋白质特异等电点。一般来说,游离氨基酸数目越大,蛋白质的特异等电点越高,蛋白质易与螯合剂反应,从而产生较高的标记率,但其标记比率与免疫反应不成正比关系。标记抗原(抗体)上的自由基团主要是2NH+

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和2C OO-,双功能螯合剂应能与2NH+4和2C OO-相连,一侧基团与铕离子螯合。最常用的标记方法是多肽或抗体2 IgG2Eu3+的标记,主要使用P2IC B2DTT A2Eu3+和IC B2E DT A2 Eu3+双功能螯合剂形成Eu3+2螯合剂2抗体复合物,结合反应动力学,标记率依赖反应体系的pH值、温度和时间,标记条件以pH9.0～9.3的标记结合率最高,反应时间以14～24h,温度以(10±2)℃为宜,螯合剂2Eu3+与IgG的可分之比以80～320倍为高。生物素2亲合素系统与荧光标记方法结合(Eu3+2S A2BI2xIgG)建立一种超灵敏度的检测方法,可用于肿瘤标志物、多肽类激素和甾体类激素检测。一个IgG分子联结4～5个生物素分子是适宜的,半抗原衍生物生物素化,每个分子联结1～3个生物素分子可满足检测的灵敏度;②镧系离子Eu3+可用来标记核酸探针。将DNA探针上耦联半抗原,当杂交后,加入一抗,产生免疫反应,再加入Eu3+标记的二抗IgG,最后同过检测Eu3+荧光强度来对DNA定量。应用IC B2 E DT A与BS A系统标记DNA探针,已用于临床血清样本检测。在PCR扩增检测产物的同时将Bio2dUTP掺入到产物中,用S A2Eu3+与Bio2PCR产物结合,洗去未结合物,测量荧光强度,可用来检测基因缺陷。③Leinonen等[9]最早用Eu3+和Sm3+双重标记分析了PS A。Eu3+和Sm3+是常用于双标记分析的一对稀土离子,在增强液中加入稀土离子Y3+协同剂邻非罗啉,在不同发射光波长下,用荧光计同步测定Eu3+和Sm3+的荧光强度,有利于提高灵敏度,也可检测同一样品中两种以上的抗原或抗体,Y3+能使Eu3+和Sm3+的荧光信号大大加强。

2.2.3　反应模式　目前常用的有双位点夹心法和固相抗体竞争法。①双位点夹心分析法使用针对被测物上不同抗原决定簇的两个单克隆抗体,一个用Eu3+标记,另一个包被固相载体,经过免疫反应形成免疫复合物后,再将Eu3+从复合物上完全解离下来,在Eu3+的增强液中与另一种螯合剂结合,在协同剂的作用下,形成一个Eu3+包裹于其内部的微胶囊(胶态分子团)。它在激发光作用下能发射出很强的荧光信号,其强弱与待测抗原(或抗体)含量相关。该法用于测定蛋白质类大分子化合物。②固相抗体竞争法是对一些小分子半抗原化合物,因分子质量小,不能直接进行固相包被,如多肽、甲状腺激素类和一些药物等,都必须经过化学耦联剂与载体蛋白质进行共价键结合,然后可包被聚苯乙烯微量滴定条孔壁,制成固相抗原。其原理是:限量固相抗体与Eu3+

标记抗

原和样品中的待测抗原竞争性结合,样品中的抗原浓度越高,

固相抗体结合的Eu3+标记抗原量就越少,反之亦然,即固相

抗体上的荧光信号强度与样品中的抗原浓度成反比。

3　TRPFIA的应用

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医学综述2006年4月第12卷第7期　M edical Recapitulate,April2006,V ol.12,N o.7

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