感受态细胞的制备

感受态大肠杆菌制备方法

四川大学生命科学学院

试剂配制：

A液：1M，MnCl2；mol/L

B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；

C液：称取CaCl20.10g，KCl1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水（一级水），轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。

TB缓冲液：

方法步骤：

1、溶液配制取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加

入3.3mlA液，混匀冰浴即可使用。

2、划线得到单菌落37℃培养箱培养过夜（约17h），挑取2-4个形态饱满的单菌落接种

于装有100mlSOB培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300rpms）培养3-4小时,将培养温度调至18℃剧烈振荡（328rpms）培养，

3、其余与普通感受态差不多，每管加入4mlTB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，

4、加入280mlDMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5mlEP管，冰上静置15分钟。

5、用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12

小时以上

6、取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。

效率非常高，一般可到10×8，好时可到10×9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。

洁净是最重要的。无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g5min。涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。

预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果