抗大肠杆菌O157_H7鸡卵黄抗体的制备及其被动保护作用的研究

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文章编号:1002-2694(2002)02-0017-03

抗大肠杆菌O157∶H7鸡卵黄抗体的制备

及其被动保护作用的研究

王忠泽1　侯晓军1　荫　俊1　宋　伟1　张松乐1　王　威1　白　洁2

摘　要:目的　制备鸡蛋卵黄免疫球蛋白IgG抗体(YolkImmunoglobulin,IgY),研究其对肠出血性大肠杆菌(EHEL)O157∶H7的被动保护作用。方法　采用EHECO157∶H7933菌株制备抗原,免疫SPF莱杭鸡,用脱脂和盐析的方法,从其所产鸡蛋中提取IgY抗体,用所得抗体对乳鼠进行动物毒性试验及动物被动保护实验。结果　用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测提取IgY抗体滴度达到1∶200000以上,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测所提取抗体纯度及回收率较高。未发现

IgY抗体对动物的毒性作用,被动保护实验结果表明,IgY抗体对乳鼠感染模型具有明显的保护作用。结论　(1)通过常规免

疫技术,可使SPF鸡产生高效价的IgY抗体。(2)脱脂和盐析是一种简便有效的IgY抗体制备方法。(3)建立了EHECO157∶

H7的乳鼠肠道感染模型。(4)IgY抗体是治疗肠道感染的一种有潜力的口服药物。

关键词:大肠杆菌;O157;卵黄抗体;保护作用

StudyofpreparationofagainstEscherichiaits

G,HOUXiaojun,YINJun,etal

(InstituteofMicrobiologyandEpidemiology,Beijing100071)

ABSTRACT:Aim　ToprepareYolkImmunoglobulin(IgY)andstudythepassiveprotectiveeffectofIgYagainstEHECO157∶H7.Methods　Number933stainofEHECO157:H7wasusedtoprepareantigenandthenSPFLaiHangchickenwasimmu2nized.IgYantibodywasextractedfromtheprolificeggsthroughdegreaseandsaltingoutmethods.AndthentheIgYwasusedintheexperimentsofsucklingmicetotestthetoxityandtheprotectiveeffectofit.Results　ThetiterofIgYwasabove1∶200000byELISAassay.ThepurityandrecoveryrateoftheIgYweobtainedishigh.ThetoxitytoanimalofIgYwasnotfound,andthepassiveprotectiveexperimentshowedthatIgYhasevidentprotectiveeffecttothesucklingmiceinfectingmodel.Conclusions　(1)HightiterIgYantibodymaybeyieldedfromSPFchickenthroughroutineimmunitytechnology.(2)Degreaseandsaltingoutaresimpleandcon2venientmethodsinpreparingIgY.(3)SucklingmiceintestinaltractinfectingmodelofEHECO157∶H7wasestablished.(4)IgYan2tibodyisanaliveoralmedicamenttocureenteralinfection.

　　KEYWORDS:EscherichiacoliO157;IgY;Protectiveeffect　　中图分类号:R37812+1　文献标识码:A

　　近年来,世界范围内出现了大肠杆菌O157∶H7

1〕不同规模和区域的流行〔,引起了各国普遍关注,

1　材料与方法1.1　材料

1.1.1　菌株　EHECO157∶H7国际标准株(933菌

株),购自中国预防医科院流研所。

1.1.2　动物　28周龄SPF莱杭产蛋鸡,购自北京

对该菌的防治也逐渐深入。文献报道〔2〕在肠道感染的动物模型中,通过口服给予特异性抗体有良好

的保护作用,提示肠道感染的口服被动免疫治疗可能具有潜在的应用前景。有人发现〔3〕来自鸡蛋卵黄抗体可以成为有效的获得免疫球蛋白的来源。在此基础上,通过优化技术路线,我们获得了纯度较高的抗E.coliO157∶H7的IgY,并对其进行了保护作用的研究。

实验动物中心,饲养于本所二级动物室。5日龄昆明种乳鼠,Ⅱ级4周龄BALB/c小鼠,由本院动物中心提供。

作者单位:11北京微生物流行病研究所(北京,100071)

21白求恩医科大学第二临床医院

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1.1.3　试剂及仪器:生物素化鼠抗鸡IgG为Sigma

公司产品,标准IgY抗体为Promega公司产品,A2vidin-HRP购自华美公司。硫酸铵为北京化工厂出品。GD3022A型酶联免疫检测仪为国营华东电子管厂产品。1.2　方法1.2.1　抗原制备及动物的免疫:将低温保存菌种活化后,2×YT培养基37℃水浴振荡培养18h,细菌计数,戊二醛灭活,制成109CFU/ml浓度,不需佐剂,作为抗原每只鸡1ml,分4点肌肉注射,2周后加强免疫一次,以后每4周免疫一次,在免疫开始时即收集每日鸡蛋。

1.2.2　IgY抗体的提取　采用了脱脂、盐析、脱盐、浓缩的纯化技术路线〔4〕。1.2.2.1　分离蛋黄与蛋白→收集蛋黄→灭菌去离子水稀释混匀→4℃静置过夜。1.2.2.2　过滤去除沉淀及漂浮物→加入固体硫酸铵粉末(240g/L),边加边搅拌→放置4℃4h→6000r/min离心15min。

1.2.2.3　收集沉淀→0.01M无菌PBS019%NaCl溶液透析去盐。

1.2.3　IgYEL内100%腹泻和死亡的攻击量(LD100),建立乳鼠的

感染模型。

6〕

1.2.8　IgY抗体的动物被动保护作用〔:将乳鼠随机分两组,用前面确定的活菌剂量经口攻击,0.1ml/只,约12h后动物发生腹泻,治疗组口服给予抗体2mg,间隔12h重复给予,共5次,观察3天,对照组按相同时间给予等量生理盐水,观察各组动物的存活情况。2　结　　果

2.1　IgY效价的测定　用ELISA法检测。在免疫

开始时所收集鸡蛋的IgY抗体滴度小于10,在加强免疫3次后,IgY抗体滴度达到2×105以上。2.2　IgY纯度及回收率的的测定　经SDS-PAGE电泳及双波长薄层扫描分析结果表明,经盐析回收的IgY抗体的纯度达到90%以上,泳道2中IgY含量很少,IgY回收率较高

,1,图2所示。

行。,3%牛血清白蛋白封闭,PBS-洗涤后,将待检IgY作倍比稀释加入孔中,孵育37℃1h,洗涤后加1∶3000生物素化的鼠抗鸡IgG,37℃1h,洗涤后加入1∶200Avidin-HRP,37℃0.5h,以新鲜配制的OPD底物溶液显色,2MH2SO4作终止液。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定OD值。

1.2.4　IgY抗体的纯度及回收率的检测　采用

5〕

SDS-PAGE方法进行〔。用含巯基乙醇的样本处理液处理待检IgY抗体及加硫酸铵沉淀后的上清,同时处理标准的IgY作对照。采用8%分离胶,5%浓缩胶,恒压60V电泳,当溴酚蓝指示带达到分离胶时,加大电压至100V,电泳完毕取出凝胶,进行考马斯亮蓝染色,进行双波长薄层扫描,分析IgY纯度。

1.2.5　IgY抗体蛋白含量的测定　用紫外分光光度计测量所提抗体的蛋白含量。1.2.6　IgY抗体毒性的测定　将BALB/c小鼠随机分为两组,每组8只,空腹6h后,采用灌胃法,一次给予IgY抗体60mg,对照组给予无菌生理盐水,观察动物的反应。

1.2.7　乳鼠感染模型的建立　将乳鼠随机分组,各

图2　抗O157:H7IgY薄层扫描图谱

Fig.2　ThearrowindicatesthepositionofIgYantibody

图1　SDS-PAGE检测抗O157∶H7IgY

Fig.1　TestofIgYofanti-O157:H7bySDS-PAGE

1.standardIgY(Promega公司)2.supernatant

afterab2stractingIgY3.abstractedIgY

组采用不同剂量的活菌经肠道攻击,选择乳鼠72h

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2.3　IgY抗体蛋白含量的测定　经检测,所提抗体

的蛋白含量为50～60mg/ml,每只鸡蛋可提取抗体50-60mg。

2.4　IgY毒性的测定　小鼠一次性口服60mg抗

动物,按常规方法进行免疫,免疫效果较好。IgY的

提取采用了脱脂、盐析、脱盐、浓缩的技术路线。在抗体提取时,经过多次试验,找出了IgY的提取的

9〕

适宜条件。在IgY毒性试验中,我们根据文献〔提供的治疗剂量(80～300mg/Kg)的10～40倍进行试验,没有发现毒性反应,说明其安全性好。有研究证明,大肠杆菌对动物的致病性与动物年龄相关,本文在建立动物肠道感染模型时,经多次试验也发现昆明鼠及BALB/c成年鼠对O157∶H7不敏感,而昆明

体,活动饮食正常,未出现不良反应。

2.5　乳鼠感染模型的建立　一次性给予5×108活菌攻击,约12h出现腹泻,72h内,乳鼠100%死亡。2.6　动物被动保护试验　动物存活情况如下表1。

表1　IgY的乳鼠被动保护试验

Table1　PassiveprotectivetestofsuckingmiceofIgY

GroupControlIgYtreatment

Amountof

animal

88

Amountofdeath

82

Amountofsurvive

06

系乳鼠对此菌敏感,所建立的乳鼠肠道感染模型具有敏感、稳定、重复性好的特点,为研究O157∶H7的致病机理、感染免疫以及被动免疫保护作用打下了基础。乳鼠被动免疫保护试验结果表明口服IgY抗体对O157∶H7感染的乳鼠模型具有明显的保护作用,这为O157∶H7的防治及其它肠道传染病的被。4　11,EnterohemorrhagicEscherichia-an].AmFamPhysician,1997,2TA,UmezuK,etal.Preventionofrotavirusinfectionbyadministrationofcowcolostrumcontainingantihumanrotavirusantibody.Med[J].Microbiol.Immunol,1985,174∶177.

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χ2分析),二者之间有显著性差　　经统计学检验(

异(P<0.01)。3　讨　　论

O157∶H7属于致病性大肠杆菌,血性肠炎、腹泻、溶血性尿毒症等症状,素Stx1和Stx2,过食物传播,。文献报道在动物模型中,通过口服给予特异性抗体有良好的保护作用,抗体可来自血清,乳汁甚至单克隆抗体,但因抗体来源的昂贵阻碍了此疗法的发展。而与常规的抗体制备方法相比,从鸡蛋卵黄中制备特异性抗体具有产量高,稳定性好和制备成本低廉的优点,是大规模获得治疗用抗体的有效方法。研究发现IgY具有良好的稳定性,对胰蛋白酶和糜蛋白酶稳定,在体内吸收很少。已发现IgY能有效地预防鼠类的轮状病毒的感染,对肠产毒性大肠杆菌(ETEC)对乳猪的攻击具有保护作用,无副作用。据以上研究,本文通过制备抗O157∶H7特异性IgY抗体,在建立的乳鼠肠道感染模型中考察IgY被动免疫治疗的效果。在免疫动物时,为降低本底抗体水平,提高免疫效果,选取了SPF莱杭鸡作为免疫

(上接第133页)

21余樟友,吕跃民,等1衢州市流行性出血热流行病学调查分析

　　(本次调查蒙省站流行出血热实验室的大力支

)持,谨致谢意。4　参考文献

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2000年3月18日收稿