抗大肠杆菌O157_H7鸡卵黄抗体的制备及其被动保护

抗大肠杆菌O157_H7鸡卵黄抗体的制备及其被动保护作用的研究

2002,18(2)

中国人兽共患病杂志ChineseJournalofZ

oonoses

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文章编号:1002-2694(2002)02-0017-03

抗大肠杆菌O157∶H7鸡卵黄抗体的制备

及其被动保护作用的研究

王忠泽1　侯晓军1　荫　俊1　宋　伟1　张松乐1　王　威1　白　洁2

摘　要:目的　制备鸡蛋卵黄免疫球蛋白IgG抗体(YolkImmunoglobulin,IgY),研究其对肠出血性大肠杆菌(EHEL)O157∶H7的被动保护作用。方法　采用EHECO157∶H7933菌株制备抗原,免疫SPF莱杭鸡,用脱脂和盐析的方法,从其所产鸡蛋中提取IgY抗体,用所得抗体对乳鼠进行动物毒性试验及动物被动保护实验。结果　用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测提取IgY抗体滴度达到1∶200000以上,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测所提取抗体纯度及回收率较高。未发现

IgY抗体对动物的毒性作用,被动保护实验结果表明,IgY抗体对乳鼠感染模型具有明显的保护作用。结论　(1)通过常规免

疫技术,可使SPF鸡产生高效价的IgY抗体。(2)脱脂和盐析是一种简便有效的IgY抗体制备方法。(3)建立了EHECO157∶

H7的乳鼠肠道感染模型。(4)IgY抗体是治疗肠道感染的一种有潜力的口服药物。

关键词:大肠杆菌;O157;卵黄抗体;保护作用

StudyofpreparationofagainstEscherichiaits

G,HOUXiaojun,YINJun,etal

(InstituteofMicrobiologyandEpidemiology,Beijing100071)

ABSTRACT:Aim　ToprepareYolkImmunoglobulin(IgY)andstudythepassiveprotectiveeffectofIgYagainstEHECO157∶H7.Methods　Number933stainofEHECO157:H7wasusedtoprepareantigenandthenSPFLaiHangchickenwasimmu2nized.IgYantibodywasextractedfromtheprolificeggsthroughdegreaseandsaltingoutmethods.AndthentheIgYwasusedintheexperimentsofsucklingmicetotestthetoxityandtheprotectiveeffectofit.Results　ThetiterofIgYwasabove1∶200000byELISAassay.ThepurityandrecoveryrateoftheIgYweobtainedishigh.ThetoxitytoanimalofIgYwasnotfound,andthepassiveprotectiveexperimentshowedthatIgYhasevidentprotectiveeffecttothesucklingmiceinfectingmodel.Conclusions　(1)HightiterIgYantibodymaybeyieldedfromSPFchickenthroughroutineimmunitytechnology.(2)Degreaseandsaltingoutaresimpleandcon2venientmethodsinpreparingIgY.(3)SucklingmiceintestinaltractinfectingmodelofEHECO157∶H7wasestablished.(4)IgYan2tibodyisanaliveoralmedicamenttocureenteralinfection.

　　KEYWORDS:EscherichiacoliO157;IgY;Protectiveeffect　　中图分类号:R37812+1　文献标识码:A

　　近年来,世界范围内出现了大肠杆菌O157∶H7

1〕不同规模和区域的流行〔,引起了各国普遍关注,

1　材料与方法1.1　材料

1.1.1　菌株　EHECO157∶H7国际标准株(933菌

株),购自中国预防医科院流研所。

1.1.2　动物　28周龄SPF莱杭产蛋鸡,购自北京

对该菌的防治也逐渐深入。文献报道〔2〕在肠道感染的动物模型中,通过口服给予特异性抗体有良好

的保护作用,提示肠道感染的口服被动免疫治疗可能具有潜在的应用前景。有人发现〔3〕来自鸡蛋卵黄抗体可以成为有效的获得免疫球蛋白的来源。在此基础上,通过优化技术路线,我们获得了纯度较高的抗E.coliO157∶H7的IgY,并对其进行了保护作用的研究。

实验动物中心,饲养于本所二级动物室。5日龄昆明种乳鼠,Ⅱ级4周龄BALB/c小鼠,由本院动物中心提供。

作者单位:11北京微生物流行病研究所(北京,100071)

21白求恩医科大学第二临床医院

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1.1.3　试剂及仪器:生物素化鼠抗鸡IgG为Sigma

公司产品,标准IgY抗体为Promega公司产品,A2vidin-HRP购自华美公司。硫酸铵为北京化工厂出品。GD3022A型酶联免疫检测仪为国营华东电子管厂产品。1.2　方法1.2.1　抗原制备及动物的免疫:将低温保存菌种活化后,2×YT培养基37℃水浴振荡培养18h,细菌计数,戊二醛灭活,制成109CFU/ml浓度,不需佐剂,作为抗原每只鸡1ml,分4点肌肉注射,2周后加强免疫一次,以后每4周免疫一次,在免疫开始时即收集每日鸡蛋。

1.2.2　IgY抗体的提取　采用了脱脂、盐析、脱盐、浓缩的纯化技术路线〔4〕。1.2.2.1　分离蛋黄与蛋白→收集蛋黄→灭菌去离子水稀释混匀→4℃静置过夜。1.2.2.2　过滤去除沉淀及漂浮物→加入固体硫酸铵粉末(240g/L),边加边搅拌→放置4℃4h→6000r/min离心15min。

1.2.2.3　收集沉淀→0.01M无菌PBS019%NaCl溶液透析去盐。

1.2.3　IgYEL内100%腹泻和死亡的攻击量(LD100),建立乳鼠的

感染模型。

6〕

1.2.8　IgY抗体的动物被动保护作用〔:将乳鼠随机分两组,用前面确定的活菌剂量经口攻击,0.1ml/只,约12h后动物发生腹泻,治疗组口服给予抗体2mg,间隔12h重复给予,共5次,观察3天,对照组按相同时间给予等量生理盐水,观察各组动物的存活情况。2　结　　果

2.1　IgY效价的测定　用ELISA法检测。在免疫

开始时所收集鸡蛋的IgY抗体滴度小于10,在加强免疫3次后,IgY抗体滴度达到2×105以上。2.2　IgY纯度及回收率的的测定　经SDS-PAGE电泳及双波长薄层扫描分析结果表明,经盐析回收的IgY抗体的纯度达到90%以上,泳道2中IgY含量很少,IgY回收率较高

,1,图2所示。

行。,3%牛血清白蛋白封闭,PBS-洗涤后,将待检IgY作倍比稀释加入孔中,孵育37℃1h,洗涤后加1∶3000生物素化的鼠抗鸡IgG,37℃1h,洗涤后加入1∶ …… 此处隐藏：4388字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……