淀粉、总糖、还原糖的测定方法

淀粉的测定方法---蒽酮法

一． 原理

用乙醇将烟叶中可溶性糖浸出并分离出去，而后烟叶中淀粉用适量Hcl，因淀粉在稀酸作用下被水解成葡萄糖，再按葡萄糖测定进行。根据葡萄糖的含量从而算出淀粉含量。

二． 仪器设备

三角瓶50ml 容量瓶100ml 移液管10ml、1ml 漏斗 圆底烧瓶1000ml 离心管和离心机 水浴锅 温度计 烘箱 滤纸 天平 分光光度计

三． 试剂

盐酸 乙醇 氢氧化钠 蒽酮

四、 试剂的配制和标准曲线的绘制

1. 葡萄糖标准液的配制 称取无水葡萄糖（AR级）0.1g溶于蒸馏水中，定容至100毫升，用前取此液10毫升，再用水稀释至100毫升。

2. 标准曲线的绘制 取6支干洁刻度试管，依次移入葡萄糖标准液（100μg/ml）0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00ml后，再从1至6试管依次补加1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0ml蒸馏水后，再分别加入蒽酮试剂5毫升，于沸水中加热10分钟，冷却后在620nm波长处比色，记录OD值，以吸光值为纵坐标，糖含量为横坐标，绘出标准曲线

3. 80%乙醇的配制 取400毫升乙醇加水定容至500ml

4. 1当量的盐酸配制 43毫升浓盐酸加水定容至500ml

5. 10%氢氧化钠配制 10g氢氧化钠溶于100ml水中

6. 蒽酮试剂：1克蒽酮溶于72%的H2SO41000ml(98%的H2SO4+240的蒸馏水)，棕色瓶冰箱保存2－3周。

五 实验步骤

1. 分离出水溶性糖

0.1g样 加入8毫升80%80℃水浴浸

提30分钟冷却后离心（3600转）5分钟 残渣再加入

8ml80%乙醇。重复三次

2. 水解

残渣用1当量的盐酸15ml洗入50ml三角瓶，摇匀后烘箱105度加热3.5小时，冷却后加10%氢氧化钠6ml中和，过滤，蒸馏水定容100ml。

3. 测定

取滤液1ml（空白用1ml蒸馏水代替），加入蒽酮试剂5ml，摇匀，于沸水浴中加热10分钟，冷却后在620nm波长处比色

六 结果的计算与表述

C=AN*0.9/W

C—样品淀粉含量（μg/g） W—样品重量（g）

A—标准曲线查得的糖量（μg） N—样品提取液占样品反应液的倍数

蒽酮比色法测总糖：

实验步骤：

1、可溶性糖的提取：准确称取烟叶样品0.100克，置于离心管中，加入8毫升80%乙醇，于80℃水浴浸提30分钟，冷却后于4000转离心5分钟，收集上清液，残渣再加入8毫升80%乙醇，再次浸提，重复两次，将三次提取的上清液合并于100毫升容量瓶中并定容至100毫升。

2、总糖的测定：取提取液1毫升于试管中（空白中用1毫升蒸馏水代替），加入蒽酮试剂5毫升，摇匀，于沸水浴中加热10分钟，冷却后在620nm波长处比色 。

蒽酮试剂：1克蒽酮溶于72%的H2SO41000ml(98%的H2SO4+240的蒸馏水)，棕色瓶冰箱保存2~3周。

3、标准曲线的绘制：取干洁试管6支，依次加入葡萄糖标准液（100μg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml和蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml，再分别加入蒽酮试剂5毫升，于沸水浴中加热10分钟，冷却后在620nm波长处比色，记录OD值，绘出标准曲线。

4、计算：C=AN/W

C—样品总糖含量（μg/g）

W—样品重量（g）

A—标准曲线查得的糖量（μg）

N—样品提取液占样品反应液的倍数

总糖、还原糖、淀粉测定所需试剂

无水葡萄糖（AR级） 蒽酮 乙醇 浓盐酸 氢氧化钠

3，5—二硝基水杨酸（DNS） 酒石酸钠 结晶酚 亚硫酸钠

滤纸，PH试纸，小标签纸

3，5—二硝基水杨酸（DNS）比色法测还原糖 仪器与用具：

25ml刻度试管；离心管；100ml玻璃烧杯；100ml三角瓶；刻度吸管1ml、2ml、10ml；沸水浴；离心机；电子天平；分光光度计。

试剂：

1. 1mg/ml葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80℃烘至恒重），在小烧杯中用蒸馏水溶解后定容至100ml，摇匀，冰箱中保存备用。

2. 3,5－二硝基水杨酸(DNS)： 6.3g 3,5－二硝基水杨酸和262ml 2mol/lNaOH，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶备用。

实验步骤：

1．可溶性糖的提取：准确称取烟叶样品0.100g，置于离心管中，加入8ml80%乙醇，于80℃水浴浸提30min，冷却后于4000转离心5min收集上清液，残渣再加入8ml80%乙醇，再次浸提，重复两次，将三次提取的上清液合并于100ml容量瓶中并定容至100ml。

2．还原糖的测定：取提取液1ml于试管中（空白中用1ml蒸馏水代替），加入DNS试剂1.5ml，摇匀，于沸水浴中加热5min，取出后立即浸入冷水冷却至室温定容至25ml，摇匀，然后在540nm波长处比色 。

3．标准曲线的绘制：取干洁25ml试管6支，依次加入葡萄糖标准液（1mg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml和蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml，再分别加入DNS试剂1.5ml，于沸水浴中加热5min，取出后立即浸入冷水冷却至室温，再用蒸馏水定容至25ml刻度处，摇匀，然后在540nm波长处比色 。

4．计算：还原糖（％）=〔（C×V/a）/(W×1000)〕×100

C—标准曲线方程求得的还原糖含量mg数；

V－提取液的体积（ml）；

W—样品重量（g）;