柱前衍生HPLC法测定丙戊酸钠的血药浓度及其临床应用

发布时间：2024-11-28

安徽医药　AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal　2010Mar;14(3) 289

陈　艳,袁　君,王晓娟,岳一涛

(淮南市第一人民医院药剂科,安徽淮南　232007)

摘要:目的　建立柱前衍生HPLC法测人血清中丙戊酸钠血

药浓度的试验方法及临床应用。方法　将血清酸化后用正戊烷提取,2溴苯乙酮和三乙胺衍生,然后用HPLC法进行测定,其中色谱柱为大连依利特ODSC18,流动相为甲醇ζ水(65ζ35),柱温30℃,检测波长262nm,流速为1.2ml -1

min。结果　丙戊酸钠浓度在20～200mg L-1范围内与峰面积比线性关系良好(r=0.9996),最低监测浓度为7mg L-1,平均方法回收率为99.6%,萃取回收率为96.6%,日内日间RSD均<4%。结论　该方法简便快捷,灵敏准确,可应用于丙戊酸钠血药浓度的快速检测,本院采用该方法监测了23例病人,效果良好。

关键词:HPLC;丙戊酸钠;柱前衍生;血药浓度;临床应用μmvalproate,简称VPA)丙戊酸钠(sodi

环又不含氮原子的广谱抗癫痫药,、—,痫发作的首选药物。[A测定的方法有GC法和HPLC荧光法,其中HPLC紫外法关键

基金项目:淮南市科技计划项目(No200702030)

在于药物的萃取和衍生,本文参照文献的基础上[2,3],根据本

院自身条件,简化操作规程,提高灵敏度,降低试验成本,建立柱前衍生高效液相色谱法测定血清中的丙戊酸钠浓度,适合临床常规检测。1　材料1.1　仪器　高效液相色谱仪为岛津LG210ATvp,SPID210Avp紫外检测器;N2000色谱工作站;湘仪L600离心沉淀机;光学读数分析天平(湘仪天平仪器厂);旋涡混合器(上海医科大学仪器厂);D1810C自动双重纯水蒸馏器(上海申胜生物技术有限公司)。1.2试药、Merck公司生产);1

-1

4、;自制重蒸馏水;对照品;。　2.1　色谱条件　色谱柱:大连依利特ODSC18色谱柱(4.6mm×150mm,5μm);流动相为甲醇∶水(65∶35);柱温:30℃;检测波长:262nm;流速:1.2ml min-1;内标物:环己烷羧酸;定量环进样20μl。2.2　试验溶液的配制

　　加样回收试验:取已知含量的同一批(批号为20070119)

供试品,精密称取6份,按低、中、高剂量分别加入甲氧苄啶对照品溶液(40.13mg L-1)适量,按供试品溶液的制备方法处理,依法测定,结果见表1。

表1　甲氧苄啶加样回收试验结果(n=6)

样品含量/mg L-1加入量/mg L-1测得量/mg L-1回收率/%

20.1220.20.20.20.20.

1212121212

16.0516.20.20.24.24.

0506060808

36.0135.39.40.43.43.

9796039978

99.0098.98.99.99.98.

7590251326

3　讨论

参考文献[4,6],对甲氧苄啶对照品溶液在251～300nm波长范围内进行扫描,结果271nm波长处有最大吸收,故选择271nm为检测波长;参考文献比较几种不同比例流动相后,认为乙腈-水-三乙胺(200∶799∶1)(用冰醋酸调节溶液pH值至5.9)最佳,配制过程相对简单,峰形较好,可免除干扰。本法所用的色谱条件能较好地分离甲氧苄啶与杂质,且测定结果与药典方法基本一致,表明用本法测定甲氧苄啶片含量是可行的。参考文献:

[1]　国家药典委员会.中国药典(二部)[S].北京:化学工业出版

社,2005:118.

稳定性试验:取同一供试品溶液,分别于0,1,2,4,6,12h

测定。结果甲氧苄啶峰面积分别为:1826,1821,1815,1801,1814,1817,峰面积的RSD为0.31%(n=6),表明样品在12h内稳定。2.4　样品含量测定[5]　按拟定的含量测定方法对3批样品进行测定,并与UV法测定结果比较,结果见表2。

表2　样品含量测定结果

批号

20070119

20070413[2]　齐成男,杨仕杰,万海江.HPLC法测定克痤隐酮乳膏中甲氧苄

啶的含量[J].黑龙江医药,2006,19(3):165-6.

[3]　皮　立.用反相高效液相色谱法测定复方头孢氨苄胶囊中头孢

氨苄和甲氧苄啶的含量[J].沈阳药科大学学报,2000,17(2):

119-20.

[4]　高秀蕊,王秀萍.HPLC测定复方头孢氨苄中的头孢氨苄和甲氧

苄啶含量方法的改进[J].中国抗生素杂志,2004,29(11):694

-6.

[5]　王宝佳,邱　洪,王福兰.高效液相色谱法测定复方四环素片中

含量(标示量的%)

HPLC法95.67

97.53UV法93.8996.12甲氧苄啶含量[J].中国药业,2008,17(21):29-30.

[6]　严宏凤.UV法测定复方磺胺甲噁唑片中磺胺甲噁唑和甲氧苄

啶的含量[J].中兽医医药杂志,2008,27(3):46.

(收稿日期:2009-11-26)

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低、中、高3种浓度的血清标准液按照2.3项下处理后进样测

定,每日5次和连续测定5d,测定日内和日间精密度。结果见表2。

表2　回收率及精密度测定结果±s,n=5)

加入量

/mg L

-1

2.2.1　丙戊酸钠储备液　精密称取VPA对照品50mg至50ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度配成浓度为1000mg L的

-1

对照品溶液,4℃保存。

2.2.2　内标溶液　精密量取50μl环己烷羧酸(密度1.03kg

-1

L)至50ml容量瓶中,用0.2mol L-1氨水稀释至刻度,再取该液7.5ml至50ml容量瓶中用0.5mol L的氨水甲醇稀释至刻度,定容得到154.5mg L-1的环己烷羧酸溶液,在温度4℃中冷藏保存。

2.2.3　衍生化试液　称取

-1

实际测得量

/mg L

-1

回收率

/%96.7

95.397.9

日内

RSD/%1.81.81.9

日间

RSD/%2.61.22.0

2溴苯乙酮250mg至25ml容量

20.40

90.30200.60

-1

19.73±0.3786.06±1.61196.393.81

瓶中,用乙腈稀释至刻度,即得10g L-1衍生化试剂溶液,

4℃保存。2.3　血样处理　精密量取内标溶液50μl于15ml尖底玻璃离心管中,用N2小心吹干,加入精密吸取的血清100μl,再加

1mol L的H2SO4溶液100μl,摇匀,加正戊烷4ml,旋涡

-1

2.6　临床应用　丙戊酸钠有效血药浓度为50～100mg

,目前临床测定的23例患者中,低于下限的有9例,占39.1%,调整给药剂量后患者癫痫症状逐渐变轻;高于上限的

混合3min,离心5min(3000r min-1),

小心吸取上清液,转移至10ml尖底玻璃离心管中,加2溴苯乙酮、三乙胺各10

μl,摇匀,置50～55℃水浴中衍生化反应10min,用N2吹干。残渣加流动相100μl溶解,取20μl进样,空白血清及含药血清的色谱图见图1、2。内标及VPA的保留时间分别为8.615、18.565min,血清内源性物质对测定基本无干扰。

有2例,占8.7%,患者均为自行超量服用出现了头晕、乏力、震颤、共济失调等不良反应,停药一周后中毒症状消失;在有效范围内的有12例,占52.2%。结果见表3。

表3　23/mg-1-06110.02

9122

百分率/%

39.18.752.2

3　讨论

　　注:A.环己烷羧酸;B.丙戊酸钠

2.4　标准曲线的制备　精密量取适量上述配制的VPA储备液于10ml玻璃离心管中,用N2小心吹干,加入空白血清2.0

ml,混匀,得血药浓度分别相当于20、60、90、160、120、200mg

L-1的VPA血清标准液。按2.3项方法操作,进样检测,记录色谱。以上述浓度VPA峰面积和内标峰面积之比(X)对VPA血清浓度(Y)作回归,得回归方程为:Y=0.01045C+

1.001007。结果表明,VPA在20～200mg L浓度范围内

-1

与峰面积比线性关系良好。以信噪比(S/N)=3ζ1计,丙戊酸钠最低检测浓度为6mg L-1,丙戊酸钠最低定量限为

18mg L

-1

2溴苯乙酮为衍生化试剂,

在三乙胺的催化下,反应完全彻底;经试验发现VPA在波长262nm处吸收最强;流动相选择甲醇∶水(65∶35),基线稳定,流动相不需使用缓冲液等盐类物质,有利于保护色谱柱;萃取选用二氯甲烷、二氯甲烷/乙醚、正戊烷、正己烷[4,5],经反复试改,用正戊烷提取药物峰形理想,分离效果好,柱效高,正戊烷虽然沸点很低,但在常温下,其挥发性对吸取操作无影响,水浴温度高于其沸点,因此水浴过程中,正戊烷逐渐挥发至干或近干,部分样品有微量液体残留,所以最后仍需氮气吹干。3.2　临床监测　进行临床应用的过程中,抗癫痫药大都有不良反应,在剂量不当或药物相互作用而至血药浓度过高时尤易发生。因此,在整个治疗期内宜高度警惕,结合血药浓度监测结果来随时调整剂量[6,7]。柱前衍生HPLC法测定VPA血药浓度,方法简便快捷,精密度好,回收率高,试验成本低,适用于丙戊酸钠的临床血药浓度监测。参考文献:

[1]　展　翔.丙戊酸血药浓度监测与临床合理用药[J].医药论坛杂

3.1　色谱条件的选择　本法采用

。

2.5　回收率与精密度

2.5.1　提取回收率试验　分别配制浓度为20、90、200mg L

-1

3个低中高VPA血清标准液。按2.3项下方法处理后进

样,以此峰面积(R1)与未经提取的相同量标准品同法衍生后

的峰面积(R2)之比计算提取回收率。提取回收率=R1/R2×

100%。结果见表1。

表1　提取回收率测定结果±s,n=5)

浓度