抗体ProteinA纯化方法
时间:2025-04-07
时间:2025-04-07
抗体ProteinA纯化
一. ProteinA柱子的制备
1. 配制溶液;
结合/洗涤缓冲液:NaCl,0.5M ;Na2HPO4 ,20mM ;PH8.0。
配制500ml的方法:
称取NaCl 4.383g,Na2HPO4 3.5814g溶解于450ml的双蒸水中。调节PH为8.0,补加双蒸水至总体积500ml。
2. 制备空柱子
(1)先打开用过的PD-10上盖,拿掉上面的盖膜。盖上盖子,摇晃,倒去里面的填料,用PBS清洗3次。
(2)用胶带固定好PD-10空柱子,要求垂直放置。
(3)在PD-10空柱子里加入2ml的Binding Wash buffer.结合缓冲液。
(4)ProteinA填料混匀,(10ml包装一小瓶)。
(5)加入5ml的ProteinA到柱子中。
(6)
(7)
(8)
二.纯化步骤
1.
2.
3.
4.
5. 样品准备;将兔血清与结合缓冲液1:1混合,过滤(防止堵塞柱子)。 平衡柱子:用5-10倍体积的结合缓冲液过Protein A柱。 上样:将准备好的血清样品上样,根据柱子的结合能力考虑上样量的体积。 洗脱杂蛋白:用结合缓冲液冲洗柱子,直至结合液中不含蛋白。 收集抗体:用洗脱液过柱,同时收集漏出液(约3-4ml/管),直至漏出液中不含蛋白。
测定各收集管中的蛋白含量,合并蛋白管。(注意:收集管中需事先加入约150ul的1M PH9.0 Tris-HCl缓冲液,防止抗体在过酸的环境下失活)
6. 柱子再生:用5-10倍体积的再生液再生柱子。
7. PBS透析收集的抗体。
三.试剂的制备
1. 结合缓冲液1000ml 500ml
甘氨酸 112.6g 56.3g
氯化钠 175.2g 87.6g
氢氧化钠调PH至9.0
2. 洗脱缓冲液500ml
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