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1 8卷第第1期0 208年1 月江苏大学学报 (学)医版 Jun lo i g U iuri (dc e E oi) oraf J n sn svyMe i itdn a e t n iV0 . No. 81 1 1Jn0 8 a .20

Ⅱ型原胶蛋抗白血清制的和备测检旭淦姜朱，敏娟，葛彦，吴文亮，陈盛霞，许化溪 (苏江大学学医技学术院，江苏镇江22 1 )013

[摘

要]目的： 探讨型Ⅱ胶原蛋白o(le rntte,ⅡCⅡ体)产生规，律cl npo gi p aey 抗制备Ⅱ抗C血清。方法：用纯 采化的和猪鸡C免Ⅱ疫新西兰兔白，隔 1每 0收d血清集，改以良闻接E I法A检测抗 C抗Ⅱ效价体结。果：CⅡ疫免L S鸡西新兰白兔后 ,1第0天体抗效为价1230 2:,第00升天至 2 184 0强免疫后，加3:0 0; 0第天第和 40天抗体效分价达别到 14 90和 1 869 20: 0 0: 1。猪 C0免Ⅱ疫西新兰白兔后 1, 0天第血清中未能测检抗出体，2第 0天血清抗效价体为 1 230强加免疫， 3:后0;第 0天第和 4 0抗天体价分效别为 1 5:0 10和1 14202:0 0。论：结纯化用的鸡和猪 C免I疫采 1新西兰白后兔，经一定潜伏血期清出中现抗体，可以获得效高抗价CⅡ体血抗。清抗产生体况情符机体合初及再次次免应答疫的关有规律，但血清体产抗生潜的期和效价伏与不同种来属源的胶蛋白有关。原 关键词[鸡];猪；Ⅱ胶原型白蛋；Ⅱ胶原型蛋抗白体；抗酶联免疫附吸实验[中图类号分] R 4 . 466 文献[标志码]A[章编号文]71— 7 3 2 0 1) 0 03 6 1 87(0 8O— 0— 43P e a ain a d tdcino n e a if c l g rnp o n e pt r prt n e te fa tsr ol o e r i yte o oⅡaJA gun Z n n EuY h nw删 L ag, H N h -n,iU H a INGXx a-, UHM- ia G, a - e, jniC E SgxaeX ui- ( cl fod cl e hoyo JaugU isye Ze j i gnu 2 1,2h ) Snhoo M iea Tc lng i,s

nvri, hnigJ n 10 s3 Cia nt a

[ arc] Obet seT s vg ttregl atrn f ni d r dci n rpr aet Aetbat jc : oiv et e ha ue at ro ts oyop u tnad ep eta n i i -n i epa b oh s r o mol ert nt ( p ) un c lngpo ee I IC .Me d h: h e el dw i ab w tri um id w p t - i y a I It soT eN w Za hae r b ie e mn z i u n t se h idc ki n a pdCgI r e hce ni I n h tne rbt rs r olc e v r 0 dy . e Ti vrd dric l f a d et h iaea w e ecl d ete 1 y ash p o m e ni tb e e E A to Isa o td t e tette se o ni CI at oi se R tuL S me hdw a de p dot ch r i fat n id . t .e b Il ssW: hnte r ib r m. e h abt eewi smu ie i u f dc ikn CI t a t o eyets iae wr : 0 t 1 hd ya d1 2 84 0a nzd w t p r e c h e i h I。 ih ind i rsr ee 321 0 0at a n : 0 0 t b t n 2h d . Afae ose h n io yttr c n s d et : 00 a 0t a n 9:2 0 ah d y.0 t t rby o rtte a t d ie sir a oe1 4 9 6 03 th d ya d 1 81 0 tb 40t a

h Wnte r bt wr mm ie iu u fdpgC Ih no isc uidnt ed tce t 1h d y eh a i e e b i nsz dw t pre i hii,Iet tad e l o o e e da 0 tt .a bbuB t2 h ytd nio i e s1 3 20A t. b ro tr tea t d i r b r nh ci e s td:ta 0t a h a tbed ytrtw

a : 0 e f se o hn ioy t tws eet e nr a e o1 e 5 0 t t0 a n : 00 t t 0 a .C ouc i:n ea T.t io inc ne sei e r- 2 0 a dh y da 1 2410 ah dy 1 3 n4 lso h ni I a Ct d ea meg n sr Ibu at rl t nya d t aeie m t i tthcrn b ba d wnhn t e r bsie w i m fee e ca n h n t sr wuihh ie ag e to ei he ba tr m mu ie t u -n z dwi p hid c k in ad pg C r Ie che n i f l.T I e at oy po u t n aw os n ttee a teu at pfir n h n id dr ic s c n e i h rtlvn glr o yr a ydb os wi r miasc n a mmu re s so T e stnl h s as dt eos ni I n iC ioi esaw r o cr e e dor iy nep n. eh a ep aet n i r f a Itt de snr eec n ed t. a bn ihw l c gn p oe n mr i f n r e u . t lo e rt is o df fee tgn s a

[ y w s crki i;cn glnp iotp K e od]hce;p ol g er tn y eI ni oe ar t nt Iea t y onye a e I; act l gn ope y n di;ezm --l i p I b lke mum oob n s a i d i nn rse ta s y

年来研近究表明，风湿性关节炎( hu a i类 re mt doa h t,A发 )病与Ⅱ型胶原蛋白 (ol e r- rr iR的t is c lg npo a

cda d t,h,I抗cⅡ抗 体动给物输亦可注ue ri Cr)A将is产t生或有助产于生关节炎，此Ⅱc及其自身抗 体因 R对 A发的病起 着非常 重要的作用， 作用机其但和制病机致制仍清楚不不。同动物来 的源cⅡ作可抗为免疫原异动种物，仅得能到应相的抗，体不且而

ntte

I, 身自免疫反应有关 e p I CI yiI)

, R 在患 A

者血和关清节部位可测到抗检c抗Ⅱ体 ,cⅡ用 免动疫物可产生胶原诱导性节关炎 ( l oe -- c lgin na[基金目项江]苏高校省然科学指导性自计划项目 ( 6 J 03 3)江苏大学第批学六生科课研 (6 0题 1 oK D16;0 0 A9)[作简者介姜旭](淦 2 9)男，16一，教副授，博士研生，究要从主生物事学检化诊断和生物资源验免疫调节的究研。

普资维讯 tht://wwwp.cqivpcom.第1

姜期旭淦， .型胶Ⅱ蛋原白抗清血的制备和测检等 3

5助有于解了 C和抗ⅡC抗Ⅱ体在 R A疾等病中的发

用含% 1血羊清的缓冲血液清作510:稀释0, 273℃ h后洗3;次用含 1%羊血清的冲缓将液羊抗兔 酶 0标I抗G体作 1 10 g: 0稀 0释，7 Ch后洗1次3;3￣ 色显物底 T为—, O 2m l HL2O BMH2 2以 o S终止 反应/ 。检测波长 4为0 / n 3 m; m5 0 6n以定测孔D值 与性阴对平均照D值比值的大 2于者为 1阳性。 .17血清抗Ⅱ胶型原蛋抗白效价的体检测 .病机制。们我采用纯的鸡和化猪Ⅱc免疫西新兰 白兔，每隔一定时收间集血清， EI法A检测抗 cⅡ以 L S体抗效价，获得高了效 的价Ⅱ型胶原血抗清，同时对鸡和猪Ⅱ抗C产体规生律进了行比较分析和。材1料与方法11主 要试剂

将 .EIA法测检为阳性的血清作系列稀， L释采用 S上述间接E IA法测定 L,以呈 S阳的最性稀高倍释数作为清Ⅱ型胶原蛋血白抗体效价。 2结果胃蛋酶白( m er装 ,汉博士德生 物工程 A seo分武有限公司 鸡)Ⅱ型胶蛋白原参照品 ( 90 i,m ; C3 1S g a公司)2 2 5 K9~ 0; D蛋白质相对分 子质量标志物 (上海华 舜物生程工有限公司 ) H P羊抗兔 IG R; g (A 0 0上普海飞生 技术物有限公司 四甲)基联 S 40,;2 1I型原胶白蛋纯度鉴 定 . I

苯胺( M,海华 B生美物程工公司 )弗氏佐剂 上T;

从胸鸡剑突软 骨和猪节透关明软骨中，得了 获鸡Ⅱ型 胶原蛋白和猪Ⅱ胶型原

蛋， S白S PG D—其AE电泳果结图见1图表1明，型Ⅱ胶原白蛋和猪。鸡Ⅱ胶型原蛋白的电 泳行为 一致，现出3条，带均与

i a ( m公S)司g其余均为。分析纯剂。试 1 2主 仪要器.电泳仪 ( i— BoaR公d司 ) Gn e is自动 图 e;e nu G全像析分系统(澳大利亚 S) rT p冷1离冻心机 ( u; e 2美

S公 g司参照相品同。i am R A D国 ) un I紫外可见描扫酶标 (仪国，—e; i Qta￣美 B o T仪k器公司 )。 1免3疫用物动 .

25 O o 0 0新西兰白兔只 6,性雄，体量 2质 0 .~ g购 2.k4,自京江南宁种兔厂。分为两组，每组3只，别用于分l60 l 00 9 4 0 o7650 1 0

鸡0Ⅱ型原胶蛋白和猪型Ⅱ胶原蛋白的免疫。 4 1I型胶原蛋的白提取、 化鉴和定. I纯4 0 050

鸡以剑胸突软骨猪和节透关明骨为软原料，用

2 0 90 0

盐酸胍去除白蛋糖、胃多蛋酶白化、消钠盐析等化氯步骤提取与 纯化鸡Ⅱ型原胶蛋白和猪Ⅱ胶型蛋原：A相白对子分质量标志物；Sg a公司的鸡 I型胶蛋白原； 蛋 B:i本 mI C:室提取的鸡型胶原I蛋白；本室提的猪取Ⅱ型胶蛋原白 ID:白。具体法方照参文献 6[进行。 5, ]51兔抗Ⅱ胶原蛋型白抗清的制血备与标本采集 . 将2gm m精制无菌型Ⅱ原蛋胶白等量与全完/l

图11型胶原蛋白 SS PE G泳图谱电 I D - AFg 1S - i DS PA E ee tGo h rt i t o r 1p a aei n cl rpo e ipc uef r C r rpt c I o 2Ⅱ型胶2原白蛋体抗产生情况 .弗氏剂佐合混，充分化乳后，新于西兰大白兔背部的皮下进行多点射，注只 m I 3每 I型胶g原蛋白。于第 2天0加抗原追激，只腹腔注射胶刺蛋白原2。 m每g 免前疫和免后疫隔每 1静耳采脉，血离清血，0d,分 2￣ C0冻存。 1 6血清Ⅱ型抗胶蛋白抗原体的测 .一检

免疫前对免疫和后每隔1 的集兔清标血 0d采本, E AI法测定Ⅱ型原蛋胶白抗体随时间变化用 SL

情况，兔血将倍清稀比测释抗定体效价。并 2 2兔抗1鸡Ⅱ型胶蛋原白抗体产生况情. .鸡Ⅱ型胶蛋原首次免白疫新西白兰兔后，较短潜期伏经血清中即出现抗 ,体体度随滴间快时增加，抗速第10抗天体效价为 321, 2: 00第0天升至 21 8 4 0: 0 0;参照 jF等 E的 IA,法化验实条件，ui LS优i建立抗Ⅱ型 胶原蛋白抗体间接 E IA 。将新鲜法羊LS血清℃ 2 6活 i人，适量 iT(浓度 00 0mn0灭加终rs .5 mo L和 N ( C浓度 0 1 oL) 2用m lL l/)a1终.5m/ l, o/

第 20加天免强疫后，体价效进一步增加 3抗第，天0第和4 0天抗体效价别分达 到 4 19 06 1和 89: 00: 1 2 0 0。血清抗体效的变价见化图2

H。C p调 1至H 8备0用。用 7p6的0 0l磷L .H. .5om/酸盐缓冲将 cⅡ液成配 2mg￣,2 h进包行 0/ 4l 1C 被，以 1羊%血清，7C h2进行封闭；血测清继 3 0￣待

2 2 2兔抗Ⅱ型胶猪原蛋白抗体产生情况 . .猪Ⅱ

型胶蛋原白免疫新兰西大白兔后，伏较期，长潜第1 0天血清中能检未测出抗 , 2体第 0天血抗清体效

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江苏大学学报 (医学版 )

l 8卷第价为1 23 0加免强后疫， 体效价快速上升，: 0; 第抗3O和 4O天抗效体价分别为 15 0:1 0和 1240 12 0:0。清抗体血效价的化变图见3。1 X 1 50 0 1s 8X0间接血反凝应法、L ES A法等。双I扩法操作虽简单,但未变性胶原蛋白在中 p性及室条件温下易成形 H纤维，琼在糖脂胶凝内以扩难散；间接红细凝胞集反应,现出非特性异反应，型原蛋白之胶间存在交易各叉反应利，于果结断判我们。以提的可自性溶鸡 不型Ⅱ胶原白和蛋猪Ⅱ胶型蛋原作白为被包抗原，优

6X￥1 0较 4Xl s 02 l 5X 0

化实验条件，立了抗Ⅱ型胶原蛋白抗 间体接建 E AI法，了高结果的复性和特重性异，人、 SL提 在兔和血鼠清抗Ⅱ型原抗体胶检的测获得中满了

意结的果，应并用于本究中。研0

型Ⅱ原胶蛋是白目公前认的关节软骨异特性抗图2鸡Ⅱ型胶蛋原白疫免西新白兔兰后清抗体效血价的变化 F g S rm ni yoeto s Z awadw ia bt- e2 au dt t f b riN e el th r bi ne hmu ei t hc e 1 nnz diwhc kn C 1i

原，同种异种或动物 Ⅱ的型胶原蛋白免疫动都物用产生较强能的体液免 和疫胞免细疫反应J。我们2 用采化纯鸡和的猪Ⅱ胶型原蛋白免疫新西 白兔，兰每隔1 0d集收血清， IE法A测检抗型Ⅱ胶蛋原以LS白体抗及其价效研，究了Ⅱ型胶蛋原白抗体 产生律。规验结果实表明，和猪Ⅱ型胶原蛋免白疫新西

襄6鸡 1￣ 03 1 4 0X

大白兔兰后，一定潜伏期血清出中现抗体，经抗体产

生情符合机体初次况及再免疫应答次有的关律规， 可获以得高效价抗Ⅱ型胶原蛋白抗血清体进行，为胶原蛋白免研究提供疫了要必件条 。目前Ⅱ胶型原白的蛋来源主有要人、、、猪牛鸡

0

图猪3Ⅱ型胶原蛋白免疫西兰新白兔大后血清抗体效 的价变 化 gF 3 r Sm t oy t r fN eZ aad hwt ab t i u ae id i so w e l n b et n i er b i

mmuiie t i CⅡ nzd I g Ip

,等管不尽同属种型胶Ⅱ原蛋的白结相似构但，在氨基酸组和结构上成均有别区，存能在其特有抗的可原定决簇，为抗原疫同免种动时物产生的免疫应作答可能存差在异。实结验果显，Ⅱ示型胶原蛋白鸡疫免新西白兔兰后，血清出中现抗体的伏潜期短较，第 1血清中抗体效为价1 302免疫应答反应 天O: 0,强；Ⅱ型胶蛋白免疫原新西兰大白兔，后猪潜伏期 较，长 1 O天第血清中未检能测出体，抗抗滴体度低。较由此可见血清体产抗生潜的伏期和价效不与同属种来源的胶原蛋有关。白 [考文献]参We a d C, ubh iJ G,rr yJ m u meo— y en M F lr t Wg oo m .IJ ns n s3讨

论

Ⅱ型胶蛋原白软是骨基质的主

要机有成分，是关软节骨中主细要胞外质间之一。虽 在然人含体量较多，床取材临可获的数得有量限；而且但Ⅱ型胶原白蛋蛋白多糖形成与紧密 结的合，用单以纯的化难

学方法提 J目取前报所道的方法，作复杂 。,操条件不一果存，在差别。们我鸡以胸剑突软和骨 猪关结节透明骨软为料原，盐酸胍除去蛋白多糖 、用胃蛋白消酶化、化钠盐析 D和2 E 2氯维素纤处理步骤等，制备出高纯度Ⅱ的胶原型蛋白E。S6S PG电 5]D—A E,泳图谱示：显Ⅱ型胶蛋白和猪原Ⅱ胶型原蛋白的鸡电泳行一致，为出现 3条带， Sg公司鸡型Ⅱ均与 i amcen tmmant, n u tiha ti[] Er pe c u, ou iadr ma edr i sJ .x i y otG hron,0,83:3 8 8 1ot 2 0e 3 () 8— 3 4.l

吕爱平.关节软骨免 与疫类风湿关节性—炎Ⅱ型—胶原所免致性关节疫炎发病机[]制中国医基础中 J .学医志，杂00, )2( 18 . 20 6 5: 82— 5刘玲，平朱，王宏彦类，湿性风关节炎患者血 .

胶等蛋原白同相结果。示提鸡猪和Ⅱ型原胶白蛋的构相结，似存能相在同的抗原决定簇。由于Ⅱ胶型可蛋白原是 3由相条同仅链的成的构，以 SS D—所PG电泳图谱会出现 1条含高量的带和 2条仅含 AE清抗Ⅱ型胶原体抗检的测意义[及]细胞与子分免 J.疫学杂志，0 2 1 )(2 1— 8 . 2 0,8 3:82 3 量少较的 1聚体、聚体三条。带3二^ y 血 Ⅱ型胶清原白的蛋抗检测体法方有双扩法、

李宝，丽唐方,晓.东型Ⅱ胶原导关节诱炎大 庞

(鼠转第 3下页) 9

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第 1

薛红梅期， .慢性粒等细胞血病白者血清患乳酸氢脱酶、一羟丁脱酸氢酶、碱性磷酸酶平水变化的临床义意[鹏飞吴 2,汪]3 9组常对、照，组性期组又高于正常对照组 明正，说慢

薇.血清酶学指标测检在 系髓血病白的C ML患者体内L水平H同样 与患者病 的变情化 D有关。不同时 期 CL患M L者，HB H水 平析分显 H DD,示两者变化一的，致与两这种血清生酶物学性特的一致这性是相符的。 从 HL,B, H、 C内髓幼稚细 胞数间相 D H D WB 骨关关系来看， M L慢性 期患者 LH和 H 与D外 C DH周 B W血B C总数相关，骨髓幼稚细胞数间无明显 相与关性。但在加速、变期 者 L患H和 H与D急 D BH髓骨内稚幼胞细数呈正相关，进一步 明说LH 和这D D H BH平更水能反映出 C LM者体患内白病细血负胞荷。研究 发现T淋巴细胞 血白病或淋 巴瘤患者 , HL很能好反映患地者体肿瘤内负荷，预不后佳 D但者还伴有外周血嗜酸细胞升数高 J。有也究发研现L水平、H肿大、 血周原始粒红细胞比例与 D脾外[]6[ ] 5[ ]4意义[]肿瘤学杂志 0,3 9 3 3:J. 0 2(, 1)—12 03 .[陆益龙，]3徐祥生，巴荣，化疗急对性白血病患者等.干素及乳扰脱酸酶水氢的影平响 [江]大学苏 J学报.:学医，版 051 () 3 4 .2 ,05 1:—9 0Pn . eem E .D ig to u fa ka l leu o o tR i r EJa n si v el o l ia e c— c

nc p op a ts ae g o[] i eW ec y— hes t h nemh l y J .te MdWo hn a io nsh,99 195:3 r1c7,2( )16 1—93 E. t ip s enA, eL FM yo, hC nT or CRl. oA lv ne m eho r tfd oted t ntoe r te si him cnesn J.h ec of c io lsn n u aca[ r e] i nco Ca c Rr e,98,8 e n s1 84 4:.25 8Aru l S er AZ, a g e F,lt ry oJh o YZ, e .T os r gc lat1 w e o oi am rset o i o nhga nt, t ho,a d ra— k r m o tnrte er fme r g w tn te t

metr so s f mah ek m is i ee e mb c d n n ep neo unlu ea n v sr oi e im dfn i n cm[] lo,1 97, 1:3)5 m u oe ce ti Je B.od9 6 8 (0,

4 2—

i42 33.

[]

7Uu t y o,si aT I, aa i s nmia IhAd n g k,eA . C iia i ta—1l c ls ng fn a c f lo o i oh l d lT -llu e ei c n e o b d eos n ip ia a tu l ekmi i a i n c - lam p o y/ h a:mA l o o i o hl as s g ic n na b o d e snp i i a i fa u t— i f n

i MC患者 L后密预切相关。急性白血病 患者L H D水 同平样影响着患者预的后和生存，学内者研 国J究明表： H染 体色阴性、 L、 H周血嗜碱细 胞P高 D外增多 (0)骨髓内原始胞加细早粒幼细胞大于>1%,[] 8

rve bgrot c r J . uL e 0,7 3 ( ) o l apnscfo[]te k R20s, 7:1 i ao91— 0.9 52

T liJ K vsik h ee a n, c aMH F . s hr.BRn r w hs o ic o emaer t. io

1%都是>慢粒性胞细白血病预后不良的指标¨ 0…本。资显料示：性期高L H的C慢 DLM患者生的存时间短低 L于的H D CLM者患，在C LM速加急、期变组C M患 L A者P水平与骨髓内稚幼细胞数呈正相 L关因此。,ML患者血 清LH, L C AD P平水与患 的者病情有着直接关 ,系何将C如 M L者患血清 LH, D HDA P水平的测监其与指标他合结 B,H, L形成 C ML[0 1][ 9]

po gt hi m oeeo osl kam( M )Le ah licr cn y nlu e ei C o n y u一—v gail noitn te auf e il a ai t J. au t f sicdi terws citc lp mc『] v o h niHs li a oo,99 1 )(1 4 oi H s pt l 91, 4:24 115—.t h 2t6Asr m, n d,LNi s n I ta o Mt oBi l o , e . Tr1a e t m go s e t n, l—n

r o tt on r o tg a a li s 1 n ee dte m cu em adp o s v ri b e n 42u s l ec cniAL tp sinS ee J B. acr2 0, 4M a et n w dn[]rC ne, 0J1 8 i ( 17)1 4: . aG n YD, hn Y.P o t on lso hs o io de Ce rgs ca ayi f r c mynl in iclk um it xmoe a d t e o,a Haf r c r e ea w i hCo d l n h S kls soe od患者病情测预的客观指标有待临于床进一研究。步[考献文] 参1][剑邵峰，刘民忠，永钟，血清一丁脱酸酶氢与等 .

羟[]h noSig u a eX Ze h,02, J4 .Z go u h nY XYe aZ i u 60 1( ) 2—66 . 4 6 6 6

:酸脱乳氢在白血酶病患中者表达临的床义意[]中 J.国合综床临，03, 8 92:—7 2 20 1() 71 2.[收日期稿] 200 0 7— 9—1 2

[本文编辑]承何志

上(接第 3 6页 )模制型备[]中国疫免学杂，0志，26 4:5 J .2 0 (2 )03— 3 52.

kld ii emm o u b n s ao f ni lcg n ta oi is n s rn e tsy o t o l e ind e a na— ab h msrmn[]JI m ou eM o18 s2, (6) u ae uJ .m n t l,99d 1 41 3: h—

[旭淦姜， 5]盛陈霞，王卉放，可性溶Ⅱ型胶原蛋白提等 .取纯化件条的研究][临床检验杂志 06,4,6:.J 202 ( )14 4—. 8 1 2

07.

8[ D] y,Zki I kEa d Ar av ardc srel M i k, hrct.Pe r piouee s pt edpryasas no lg pn os i .J o ah u t sesnt f o le rt n][CJrm i— em ca e tr n y T c lBon dL fSi 2 0,9 1 o A at he i o i c 0 3,7 ( 0/gB l mee 22 5— 25 .): 7 4

[ 姜旭淦，] 6盛霞，陈丁建，猪霞软Ⅱ型胶原骨白蛋的等.提取纯化与定鉴[]苏江大学报学：J.医学版 0,,

66 20 (1 ) 39—31 5:8 9 .

[7 F]j Tu iMou e a. niop en— yiu,KjsM r,t K, At m vrd ezemi a 1[收稿期] 2日 07—100 —25

[文本辑编郭]

欣