16-第十六次课-实验二 7-21分光光度计的使用 血糖的测定

郑州铁路职业技术学院教师教案

实验二 721分光光度计的使用

了解分光光度法的基本原理，熟悉721分光光度计的操作方法，为今后使用该仪器奠定基础。

分光光度法（Spectrophotography）是利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一种技术。光线是一种电磁波。其中可见光波长范围约由760nm的红色-400nm紫色，波长短于400nm的光线叫做紫外线，长于760nm的光线叫做红外线。当光线通过透明溶液介质时，其中一部分光可透过，一部分光被吸收，这种光波被溶液吸收的现象可用于某些物质的定性及定量分析。

光源 单色器 测量池 接收器

参照池

有色溶液的深浅与其中呈色物质的含量呈正比关系。在定量分析中，利用比较有色物质溶液的颜色深浅来测定物质含量的分析方法称为比色法。被测物质中，有的本身就是有颜色，但多数被测物质本身无色或颜色很浅，须加入某些化学试剂使被测物质与之发生反应生成有色的物质。

物质的颜色是由于物质吸收某种波长的光线后，通过或反射出某种颜色的结果。当一定波长的单色光通过该物质的溶液时，该物质都能有一定程度的吸光作用。浓度越高，对光线吸收就越多，利用物质对一定波长光线吸收的程度测定物

质含量的方法，称为分光光度法。

分光光度法依据朗伯-比耳（Lamber-Beer）定律。设一束单色光I0射入溶液，由于部分光线被溶液吸收，通过光线为It，则It/ I0之比为透光度，若透光度为T(%)，则

T= It/ I0×100％

透光度 (T)的倒数（1/T）反应了物质对光的吸收程度。实际应用中，取1/T的对数值，做为吸光度（A），即

A=Lg（1/T）=－Lg T

依据朗伯-比耳（Lamber-Beer）定律推倒，当一束平行单色光通过均匀、无散射现象的溶液时，在单色光强度、溶液温度等条件不变的条件下，溶液对光的吸光度（A）与溶液的浓度（C）及溶液层厚度（L）的乘积成正比。即

A=KCL

在实验比色时，标准液与被测液使用相同的比色杯，即液层厚度（L）相同，K为常数。所以，溶液对光吸光度（A）与其浓度（C）之间的关系即为正比关系，溶液浓度越大，吸光度越大。

可以通过测定吸光度求待测溶液的浓度。

设：测定液的吸光度和浓度分别为Ａ测和Ｃ测，标准液的吸光度和浓度分别为Ａ标和Ｃ标，计算公式为

Ａ测：Ａ标＝Ｃ测：Ｃ标

上式中Ｃ标为已知，Ａ测和Ａ标可在比色时读出数值，把这些数值代入公式，即可测出测定液的浓度。

721-分光光度计;吸管;试管;蒸馏水;标准液(硫酸铜);待测液(硫酸铜).

1. 接通电源，打开开关指示钮，打开比色箱盖。

2. 选择所需波长(630nm)、转动灵敏度旋钮选择适宜灵敏度。

3. 转动0旋钮，使检流针对准T为0，将空白液、标准液、测定液分别倒入3个比色杯中，将比色杯放入比色盒，再将比色盒放入比色箱中，使空白液对准光路，合上比色箱盖。

4. 转动100旋钮，使检流指针对准T为100%（A为0）。预热20分钟，观察指针是否稳定。

5. 预热后，反复几次调节T=0、T= 100%，即开盖调“0”，闭盖调“100”。 6. 轻轻拉动比色槽拉杆，先后将标准液、测定液对准光路，分别记录A

标

数值和A测数值。

7. 比色完毕，关闭电源拔下插头，恢复各旋钮至原来位置，取出比色杯，合上比色箱盖。将比色杯洗净后倒置晾干。 8. 计算：根据记录的A测、A标和已知的C标3个数值。 C测=A测/A标×C标公式算出C测数值。

1.波长可选择（400～650）nm之间

2.向比色杯加入比色液时，比色杯应保持干燥，否则会导致比色液稀释 3.所加液体的量：比色杯高度的(1/2 ～2/3) 4.比色杯光面朝向光源

5.手不能触摸比色杯的光面；有液体污染时可用软布擦干

6.比色后，应将比色液倒掉，然后用自来水、蒸馏水冲洗比色杯，倒置干燥

实验三 血糖浓度测定

了解氧化酶测定血糖的基本原理，掌握氧化酶法测定血糖的实验方法及临床意义。

血中的葡萄糖与酶酚混合液反应，生成有色物质，其颜色的深浅与葡萄糖的含量成正比，与同样处理的葡萄糖标准液比色，测定红色化合物的吸光度则可计算血糖浓度。整个反应可简单表示如下：

葡萄糖氧化酶

葡萄糖+O2+H2O

葡萄糖酸+H2O2 过氧化物酶

H2O2+苯酚+4-氨基安替比林 红色化合物+H2O

血糖（G

葡萄糖标准液有色溶液（红色） 血清、葡萄糖标准液（5.55mmol/L）、酶工作液（酶酚混合液）、滴管、试管、

有色溶液（红色）

1、取试管3支，按下表操作：

试管架、微量吸液器、恒温水浴、72-1型分光光度计。

2、将上述各管混匀后放入恒温水浴（37℃）中加热12分钟，注意在恒水浴中的水面必须高于试管内的液面，否则温度不均而影响比色。

3、用波长500nm分光光度计进行比色，空白调节零点，读取测定管与标准管吸光度。 4、计算

血糖（mmol/L）=测定管吸光度/标准管吸光度×5.55 5、参考正常值：3.89-6.11mmol/L 【思考题】

讨论血糖升高和降低的临床意义及其维持恒定的因素？