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LOGO第一节 植物细胞培养产酶20世纪80年代以后植物细胞培养技术迅速发展，已成为生物工程研究 开发的新热点。主要用于色素、药物、香精、酶等次级代谢物的生 产。其中，通过植物细胞培养产酶的研究已经取得可喜进展。第四章 动植物细胞培养产酶2009.5.4一、植物细胞的特性动、植物细胞培养是通过特定技术获得 优良的动、植物细胞，然后在人工控制 条件的反应器中进行细胞培养，以获得 所需产物的过程。 与微生物细胞相比，动物细胞和植物细 胞具有各自不同的特性，需采用各自不 同的培养工艺。植物细胞结构本 章 内 容微生物、植物、动物细胞的特性比较第一节 植物细胞培养产酶 植物细胞的特性 植物细胞培养的特点 植物细胞培养的工艺条件及其控制 植物细胞培养产酶的工艺过程 第二节 动物细胞培养产酶 动物细胞的特性 动物细胞培养的特点 动物细胞培养的方式 动物细胞培养的工艺条件及其控制 动物细胞培养产酶的工艺过程细胞种类 细胞大小/um 倍增时间/h 营养要求 光照要求 对剪切力植物细胞 20-300 >12 简单 大多数要光照 敏感 色素、药物、香 精、酶等微生物细胞 1-10 0.3-6 简单 不要求 大多数不敏感 醇、有机酸、氨基 酸、抗生素、核 苷酸、酶等动物细胞 10-100 >15 复杂 不要求 敏感 疫苗、激素、 抗体、酶等功能 蛋白质主要产物1

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三者之间的差异主要有： 植物细胞>动物细胞>微生物细胞。 动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。 植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。 大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的生产 要求一定的光照强度和时间。 植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。 植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不 相同。 外植体首先要选择无病虫害、生长力旺盛、生 长有规则的植株，（如果植物细胞是用于生产 次级代谢物，则需从产生该次级代谢物的组织 部位中切取一部分组织），经清洗，除去表面 的灰尘污物； 将上述外植体切成0.5￣1cm左右的片段或小 块，用70%￣75%乙醇溶液或5%次氯酸钠、 10%漂白粉、0.1%升汞溶液等进行消毒处理， 再用无菌水充分漂洗，以除去残留的消毒剂。二、植物细胞培养的特点植物细胞培养生产各种天然产物，与从植物 中提取分离这些物质相比，具有如下显著特点。1．提高产率 2．缩短周期（植物细胞生长的倍增时间一般为12～60h，一般生产周期15～30天，远低于完整植株的生长周期）2. 植物细胞的获取（1）直接分离法：从外植体直接分离植物细胞的方法通常有机械法和酶解法两种。（2）愈伤组织的诱导法：将上述外植体植入诱导培养基 中，于25℃左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞 团。 （3）原生质体再生法：使用机械分离法或酶解法（常用）获 得植物原生质体后，经过计数和适当稀释，在一定条件下再进行原 生质体培养，使细胞壁再生，而形成单细胞悬浮液。3．易于管理，减轻劳动强度 4．提高产品质量（主要产物浓度较高，有害物质较少） 5. 其他（与微生物比较，植物细胞培养还具有对剪切力敏 感、生长周期长等缺点，此外，许多植物细胞的生长和代谢需要一定 的光照。）三、植物细胞培养的工艺条件及其控制 （一）植物细胞培养的工艺流程外植体→细胞的获取→细胞培养→分离纯化→产物外植体水稻的外植体（幼 胚）和愈伤组织1. 外植体的选择与处理是指从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养和细胞培养的植 物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。愈伤组织2

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3. 细胞培养植物细胞培养系统 MS与B5培养基的组成4. 分离纯化（二） 植物细胞培养的培养基1. 植物细胞培养基的特点 植物细胞培养的培养基与微生物培养基有较大的差别， 其主要不同在于：（1）植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐：除了磷、硫、 氮、钾、纳、钙、镁等大量元素以外，还需要碘、硼、锰、锌、 钼、铜、钴、铁等微量元素。 （2）植物细胞需要多种维生素和植物生长激素：如硫胺素、烟 酸、吡哆醇、肌醇、泛酸、叶酸、生物素和分裂素等。 （3）植物细胞要求的氮源一般为无机氮源：即可以同化硝酸盐和 铵盐。 （4）植物细胞一般以蔗糖为碳源：蔗糖的浓度一般为2%~5%。MS与B5培养基中大量元素母液（10倍浓度）的组成2. 几种常用的植物细胞培养基（1）应用最广的是MS培养基和LS培养基 MS培养基是1962年由Murashinge和Skoog为烟草细胞培养而设计 的培养基。广泛应用于植物细胞、组织和原生质体培养，效果良好。 LS和RM培养基是在其基础上演变而来的。 （2）B5培养基 主要特点是铵的浓度较低，适用于双子叶植物特别是木本植物的 组织、细胞培养。 （3）White培养基 特点是无机盐浓度较低，适用于生根培养。 （4）KM-8P培养基 特点是有机成分的种类较全面，包括多种单糖、维生素和有机 酸，在原生质体培养中广泛应用。 现将MS培养基和B5培养基的组成列表于下几页。MS与B5培养基中微量元素母液（100倍浓度）的组成3

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四、植物细胞培养产酶实例MS与B5培养基中铁盐母液（100倍浓度）的组成以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例组分 FeSO4·7H2O Na2-EDTAMFe液/g/L 2.78 3.73B5Fe液/g/L 2.78 3.73(1)大蒜愈伤组织的诱导选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外 皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%氯化汞消毒 10min，然后无菌水漂洗3次。 在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有 3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的半固体MS培养基中， 在25℃，600lux，12h/d光照条件下培养18d，诱导得 到愈伤组织，每18天继代一次。MS与B5培养基中维生素母液（100倍浓度）的组成3. 植物细胞培养基的配制 通常将各种组分分成大量元素液、微量元素液、维生 素溶液和植物激素溶液等几个大类，先配制成10倍或者 100倍浓度的母液，放在冰箱保存备用。在使用时，吸取 一定体积的各类母液，按照比例混合、稀释，制备所需的 培养基。（1）大量元素母液：即是含有N、P、S、K、Ca、Mg、Na等大量元 素的无机盐混合液。 （2）微量元素母液：即含有B、Mn、Zn、Co、Cu、Mo、I等微量 元素的无机盐混合液。 （3）铁盐母液：一般采用螯合铁（Fe-EDTA）。 （4）维生素母液：是各种维生素和某些氨基酸的混合液。 （5）植物激素母液：各种植物激素单独配制成母液。(2)大蒜细胞悬浮培养将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组 织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体MS培养基 中，加入灭菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d光 照条件下振荡培养10~12d，使愈伤组织分散成为小 细胞团或单细胞。 然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单 细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体 MS培养基中，25℃,600lux，12h/d光照条件下震荡 培养18d。（三） 培养条件的影响与控制 （1）温度一般控制在室温范围（25℃左右） （2）pH值一般控制在微酸性范围（ pH5.0~6.0） （3）溶解氧的调节控制（通气与搅拌） （4）光照的控制 （5）前体的添加（饲喂） （6）刺激剂（elicitor）的应用（常用的有微生物细胞壁碎片和果胶酶、纤维素酶等微生物胞外酶）(3)超氧化物歧化酶的分离纯化细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎， 用pH7.8的磷酸缓冲液提取、有机溶剂沉淀等，分 离得到超氧化物歧化酶。4

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第二节、动物细胞培养产酶动物细胞培养主要用于生产下列功能蛋白质：（1）疫苗：脊髓灰质炎（小儿麻痹症）疫苗，牲畜口蹄 疫疫苗，风疹疫苗，麻疹疫苗，腮腺炎疫苗，黄热病疫 苗，狂犬病疫苗，肝炎疫苗等。 （2）激素：催乳激素，生长激素，前列腺素，促性腺激 素，淋巴细胞活素，红细胞生成素，干扰素，胰岛素等。 （3）酶：胶原酶，血纤维蛋白溶酶原活性剂，尿激酶 等。 （4）单克隆抗体：通过杂交瘤细胞等动物细胞培养生产 各种单克隆抗体。 （5）多肽生长因子：神经生长因子，成纤维细胞生长因 子，血清扩展因子，表皮生长因子，纤维粘结素等。 （6）非抗体免疫调节剂：干扰素，白细胞介素，集落刺 激因子等。三、动物细胞培养的方式悬浮培养对于非锚地依赖性细胞，如杂交瘤细胞、肿瘤细胞以及来自血液、 淋巴组织的细胞等，可以自由地悬浮在培养液中生长、繁殖和新陈 代谢，与微生物细胞的液体深层发酵过程相类似。贴壁培养大多数动物细胞，如成纤维细胞、上皮细胞等，在培养过程中要贴 附在固体表面生长。可以采用滚瓶培养系统，但现在已广泛使用微 载体培养系统。这种系统具有如下显著特点：①微载体的比表面积 大，单位体积培养液的细胞产率高。②由于微载体悬浮在培养液 中，使其具有悬浮培养的优点。固定化细胞培养锚地依赖性和非锚地依赖性的动物细胞都可以采用固定化细胞培养 方式。一、动物细胞的特性 动物细胞与微生物细胞和植物细胞比较具有 下列特性：（1）动物细胞没有细胞壁，细胞适应环境的能力 差，显得十分脆弱。 （2）动物细胞的体积远大于微生物细胞，稍小于植 物细胞。 （3）大部分动物细胞在机体内相互粘连以集群形式 存在，在细胞培养中大部分细胞具有群体效应、锚地依赖 性、接触抑制性以及功能全能性。 （4）动物细胞的营养要求较复杂，必须供给各种氨 基酸、维生素、葡萄糖、激素、无机盐和生长因子等 ，还 需加入5%～10%的血清或其代用品等，所以动物细胞培 养的成本较高，主要用以珍贵药物的生产。四、动物细胞培养的工艺条件及其控制动物细胞培养的工艺过程：种质细胞→悬浮细胞→细胞培养→分离纯化→产物（一）动物细胞培养基的组成成分1. 氨基酸 必须加入必需氨基酸以及半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺 等。 2. 维生素 含血清的培养基中一般由血清提供；在血清含量低的培养 基中或者在无血清的培养基中，必须补充B族维生素，有的还补充 维生素C。 3. 无机盐 必须添加含有大量元素的无机盐，主要用于调节培养基的 渗透压；而微量元素一般由血清提供，在血清含量低的培养基中或 者在无血清的培养基中，则需添加Fe、Cu、Zn、Se等。 4.葡萄糖 作为碳源和能源使用。 5. 激素 需要胰岛素、生长激素、氢化可的松等激素。 6. 生长因子 血清中含有各种生长因子，可以满足细胞的需要。在血 清含量低的培养基中或者在无血清的培养基中，则需添加适量的表 皮生长因子 神经生长因子 成纤维细胞生长因子等二、动物细胞培养的特点 动物细胞培养具有如下显著特点：主要用于各种功能蛋白质的生产。 细胞生长速度慢，细胞倍增时间15~100h。 为了防止微生物污染，培养过程中需添加抗生素。现在 一般采用青霉素和链霉素联合作用。 细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感，在培养过 程中必须严格控制温度、pH值、渗透压、通风搅拌等 条件。 培养基成分较复杂，反应过程成本较高，适用于高价值 药物的生产。 大多数细胞具有锚地依赖性，适宜采用贴壁培养；部分 细胞，如来自血液、淋巴组织的细胞、肿瘤细胞和杂交 瘤细胞等，可以采用悬浮培养。 原代细胞一般繁殖50代后，即会退化死亡，需要重新分 离细胞。（二）动物细胞培养基的配制应首先配制各类母液，如100倍浓度氨基酸母液、 1000倍浓度维生素母液等；在使用前，分别吸取一定体积 的母液，混匀得到混合母液，膜过滤除菌后，冷冻备用； 使用时，取一定体积的混合母液，用无菌的平衡盐溶液稀 释至所需浓度。 在母液配制时，要确保所有组分都能完全溶解，并在 杀菌及保存过程中不产生沉淀。如采用无血清培养基，则 需要补充各种激素和生长因子等组分。 由于谷氨酰胺不稳定（在培养液中的半衰期，4℃时为 3周，36.5℃时为1周），要单独配制并冷冻保存。5

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（三）培养条件的影响与控制 （1）温度：一般控制在36.5℃，允许温度波动范围在0.25 ℃ 之内。LOGO（2）pH值：一般控制在pH7.0~7.6的微碱性范围内， 因为动物细胞在pH7.4的条件下生长最好。 培养基中调节pH值，通常采用CO2和NaHCO3溶液。 为了避免培养过程中pH值的快速变化，维持pH值的 稳定，通常在培养液中加入缓冲系统。 检测pH值的变化常用的指示剂为酚红。 （3）渗透压: 应与细胞内渗透压处于等渗状态， 一般控制在700~850KPa范围内。 （4）溶解氧：根据情况随时调节。一般通过调节 进入反应器的混合气体的量及其比例的方法进行 调节。2009.5.4五、动物细胞培养产酶的工艺过程现以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原 活化剂为例，说明动物细胞培养产酶的工艺过程 及其控制。1. 人黑色素瘤细胞培养基 2. 人黑色素瘤细胞培养 （1）将人黑色素瘤的种质细胞用胰蛋白酶消化处 理，分散，用pH7.4的磷酸缓冲液洗涤，计数，稀释成细 胞悬浮液。 （2）在消毒好的反应器中装进一定量的培养液，将 上述细胞悬浮液接种至反应器中，接种浓度为（1~3） ×103个细胞/mL，于37℃的CO2培养箱中，通入含5% CO2的无菌空气，培养至长成单层致密细胞。（3）倾去培养液，用pH7.4的磷酸缓冲液洗涤细胞2~3 次。 （4）换入一定量的无血清Eagle培养液，继续培养。 （5）每隔3~4天，取出培养液进行tPA的分离纯化。 （6）然后再向反应器中加入新鲜的无血清Eagle培养 液，继续培养，以获得大量tPA。 3. 组织纤溶酶原活化剂的分离纯化 在获得的上述培养液中加入一定量的蛋白酶抑制剂和表 面活性剂，过滤去沉淀，适当稀释后，采用亲和层析技术进 行分离（以tPA抗体为配基，以溴化氢活化的琼脂糖凝胶为 母体制成亲和层析剂，上柱、洗涤后用3mol/L KSCN溶液洗 脱，分部收集），得到tPA溶液。经过浓缩，葡聚糖G-150凝 胶层析、冷冻干燥得到精制tPA干粉。6