1.3 基因打靶技术的方法

基因打靶包括基因敲除和基因敲入两种方法。基因敲除（gene knock-out）是通过同源重组使特定靶基因失活，以研究该基因的功能，是基因打靶最常用的一种策略。基因敲入（gene knock-in）是通过同源重组，用一种基因替换另一种基因，以便在体内测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的根据所用靶细胞的不同，基因打靶分为胚胎干细胞打靶（Embryonic Stern cell，ES）和体细胞（somatic cel1）打靶两类。

2 基因打靶技术的建立

基因打靶技术是在同源重组技术和胚胎干细胞（ES）技术成就的基础之上产生和发展的。

2.1 同源重组技术的建立

同源重组是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中相同或者相似DNA序列间的重组。它通常通过一对同源分子非姊妹染色体间的断裂而产生新的重组片段。同源重组在进化过程中高度保守， Joshua Lederberg由于50多年前在细菌中首先证实同源基因间重组的原理而获得了1958年的诺贝尔奖，而同源重组技术的概念是20世纪70年代初在酵母研究中发展起来的，与酵母系统完全不同的是， 哺乳动物细胞中同源重组的概率非常低。1980年， Capecchi报道用玻璃针将DNA直接注射入细胞核可以显著提高基因转移的效率，随后又证明同源重组可以发生在外源DNA和哺乳动物细胞染色体的同源序列间。同时期， Smithies等提出了同源重组可能用于修复突变基因的概念，并在1985年一篇里程碑论文中报道了在红白血病细胞中实现了人工打靶载体和细胞染色体上β-球蛋白基因间的同源重组。

2.2 ES细胞分离

ES细胞是从着床前的哺乳类胚胎中分离的全能干细胞，具有较强的增殖能力， 经过长期体外培养后仍然具有分化成所有3种胚层的发育潜能。1981年， Evans等和Marin分别报道从正常的小鼠囊胚中分离了ES细胞。尤其重要的是， Evans等研究小组在1984年证实通过显微注射引入囊胚的ES细胞可以分化为成体的各种组织并整合入生殖系。1987年，Evans等和Monk等的研究小组在小鼠胚胎干细胞中分别对次黄嘌呤磷酸转移酶基因（Hprt）的进行改造， 并获得了经生殖系遗传的突变小鼠。Capecchi等发展了一种称为“正负筛选”的策略， 使中靶胚胎干细胞克隆数增加3～10倍。

2.3 基因打靶技术的制作转基因小鼠

同源重组技术与ES细胞技术的结合使得在生物整体水平上定向改变和修饰哺乳类动物的遗传物质成为可能。卡佩基和史密斯分别在1987年《细胞》和《自然》杂志发表的两篇文章标志着基因打靶技术的建立。1989年，卡佩基实验室取得了更大的进展，他们将小鼠体内的真正基因进行了敲除，并且获得了具有目的基因缺陷的小鼠。真正通过同源重组获得的基因敲除小鼠的诞生，开启了遗传学新纪元的大门。

3 基因打靶技术的应用

经过20多年的发展．基因打靶技术的基本原则未变，但是操作对象和方法都“丰富”了许多，对象除应用最多的小鼠外，还有大鼠、果蝇、细菌和猪、羊等。方法除最经典的基因敲除外，还包括基因敲入、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等。迄今为止，全世界科学家利用基因打靶技术已经对上万种基因的功能进行了研究，由此催生出新的药物（如癌基因靶向治疗药物）以及新的疾病治疗方法（如血友病基因治疗方法）等，并培育了500多种存在不同基因变异的人类疾病，如心血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病和癌症等小鼠模型 “基因打靶”技术将被越