微生物分子生态学 分析方法 基因的选择 基因组学分析方法 浸矿微生物生态规律研究

传统的微生物多样性研究方法以培养为依据:包括细胞形态、生长适温、pH值、GC含 量、微生物总量、生物量、呼吸效率、酶活性等。 仍然是微生物研究的基础; 问题： (1)由于培养条件与自然条件的差异，通过人工培 养所获得的只是自然环境中很小部分的微生物 (0.001~15%), (2)加入了浓度远高于自然环境的营养物质，使得 在新的选择压力下微生物群落结构通常会发生变化， 适应丰富营养条件的菌种可能取代自然条件下的优 势种而成为新的、人为选择的优势种。

新的发展观察微生物个体丰度和形态：荧光显微镜法、 扫描电镜法和透射电镜法等的方法，但它们 仍不能提供微生物群落多样性的足够信息。 20世纪80年代末90年代初发展了以核酸(基 因)为基础的分子生物学技术，该方法大大 地减轻对微生物培养的依赖性，并迅速地广 泛应用于微生物群落结构分析，除技术手段 本身外，这些分析还渉及到基因的选择。

一、基因的选择1、16S rRNA16SRNA或rDNA是目前微生物多样性分析常选用的基因， 优点： (1)高度的多样性，几乎应用这一方法的研究总能发现新的 微生物种群，其中大多数仍不能通过人工培养获得； (2)在基因文库中有大量序列可用于分析比较。 缺陷： (1)一个种内的多个拷贝中16S基因的异质性妨碍了基因的指 纹图谱分析，并使从克隆文库和由指纹图谱获得的序列分析变 得难以确定； (2)16S基因的异质性在不同的区段很不一致，这样使得16S 基因的识别灵敏度变化也很大。 (3)在属的大多数种间，16S基因缺乏种水平上的识别性，

建立16 S r RNA系统发育树的意义a)使生物进化的研究范围真正覆盖所有生物类群； 传统的生物进化研究，主要基于复杂的形态学和化石记载， 因此多限于研究后生生物(metazoa),而后者仅占整个 生物进化历程的1/5 b)提出了一种全新的正确衡量生物间系统发育关系的方法； c)对探索生命起源及原始生命的发育进程提供了线索和理论 依据； d)突破了细菌分类仅靠形态学和生理生化特性的限制，建立 了全新的微生物分类、鉴定理论； e)为微生物生物多样性和微生物生态学研究建立了全新的研 究理论和研究方法，特别是不经培养直接对生态环境中的 微生物进行研究。

建立16 S r RNA系统发育树的意义a)使生物进化的研究范围真正覆盖所有生物类群；传统的生物进化研究，主要基于复杂的形态学和化石记载，因此多 限于研究后生生物(metazoa),而后者仅占整个生物进化历程的1/5

b)提出

了一种全新的正确衡量生物间系统发育关系的方法；

c)对探索生命起源及原始生命的发育进程提供了线索和理论依据； d)突破了细菌分类仅靠形态学和生理生化特性的限制，建立了全 新的分类理论；

e)为微生物生物多样性和微生物生态学研究建立了全新的研究理 论和研究方法，特别是不经培养直接对生态环境中的微生物进 行研究。

“Taxonomists' counts suggest that insects dominate the diversity game, but new analyses reveal that microbes are the real winners.”

不可培养微生物(uncultured microorganisms)

从环境中直接分离并克隆rRNA并分析其序列和在分子进化树 上的位置等方法而发现的的目前尚不能在人工条件下获得培养的微 生物。

选用16s rRNA的主要原因1)普通存在于原核和真核生物细胞中； 2)有重要而稳定的生理功能； 3)在细胞中含有较大量的易于提取的 4)在细胞中不像质粒DNA那样会转移，而是稳定的； 5)某些碱基序列非常保守、以致在30多亿年的进化中仍保持 原初的状态，而不像另一些序列那样变化很大，因此可用 作探索自古至今生物的主要进化历程； 6)分于量适中，在核糖体所含的三种rRNA (23s,16s和5S) 中，其核苷酸数分别约为2900、1540和120个，其中的16S rRNA不但核苷酸数适中。而且信息量较大，且易于分析， 故是理想的研究材料。

Carl Woose的rRNA进化树完美无缺？

随着越来越多的微生物的全基因组序列的测定，人们发现生物在进化中存在着非常广泛的水平基因转移现象，很多

科学家都认为不能仅靠对16SrRNA的序列比较来确定生物之间的亲缘关系，还必须借助各种信息对这个进化树进行 改进。

2001年5月18日 美国《科学》周刊292卷 第5520期人类基因组中的细菌基因？ 一项新的研究指出，在我们体内的每个细胞中有40个左右的细菌基因，而不是 早先报告的113到233个。这个由细菌到人类寄主的所谓的“横向转移(lateral transfer)”给进化生物学带来了极大的问题，它可能意味着直到现在细菌可能一 直在为其自身利益操纵着人类的基因组。 Steven L. Salzberg和他的同事们与过去的研究人员一样，将人类基因组和已经测 序的真核细菌基因组做比较，来识别同时在人类和细菌中出现的“细菌到脊椎动 物转移”的基因(bacteria to vertebrate transfers,简称BVTs)。Salzberg的小组 分析的数据包括了塞莱拉的基因组序列和过去没有被分析过的寄生物谱系的蛋白，但 他们排除了在序列还没有完全测出的细菌中有变异的基因。

他们的结果建议，许多共有的基因在其他细菌中丢失了，在进化率不同的生 物体中有变化，采样大小的不同对结果也有影响。在一篇相关的

研究评述中， JanO. Andersson和Camilla L. Nesbo进一步讨论了这些发现。 报告：Microbial Genes in the Human Genome: Lateral Transfer or Gene Loss?, by Steven L. Salzberg, et al. 研究评述：Are There Bugs in Our Genome?, by Jan O. Andersson and Camilla L. Nesbo

2. 细菌16S-23S rDNA间区(IGS)序列功能单元：为保守区域，主要包括三个部分： (1)tRNA,不同种或同种细菌的IGS,中包含不同类型和不同 个数的tRNA,如大部分弧菌IGS中具有0-4个七RNA基因， (2)核酶iii的识别位点，位于IGS的3’和5’端。该位点参与剪 切前RNA来产生成熟的RNA的过程。

(3)酶的识别位点序列一BoxA,作为转录中的一种抗终止子。 IGS中上述的功能单元不到总长度的50%,其他区域为非必需序列：由于这些区域不具备功能，因此在进化 中受到的压力不会像IGS中功能单元的那么大，容易发生替代/ 缺失现象，就表现出更高的变异性。