酵母双杂交系统主要是从prey文库中筛选与已知蛋白(bait)有相互作用的蛋白(prey)。

第一链cDNA合成

1. 准备: 高质量的Poly A 或总RNA

2. 在微量离心管中混匀以下试剂：

1–2 μl RNA 样本 (0.025–1.0 μg poly A+或0.10–2.0 μg 总RNA)

1.0 μl CDS III 或 CDSIII/6 引物

1–2 μl 去离子水(补齐体系到4.0 μl) 4.0 μl 总体积

注意: 对照实验时，请使用1μl *1μg+ 的对照RNA。CDSIII = Oligo-dT；

引物CDSIII/6 =随机引物

3. 72°C ，孵育2 min。

4. 冰上冷却2 min，然后14000rpm，10sec，瞬时离心。

5. 混合以下试剂，将混合液加入Step4

中的经过变性且结合有引物的

RNA样本中，轻拍混匀。

2.0 μl 5X First-Strand 缓冲液

1.0 μl DTT (100 mM)

1.0 μl dNTP 混合物(10 mM )

1.0 μl SMART MMLV 反转录酶

6. 只有使用随机引物(CDSIII/6)实验才进行此步骤 [如果采用Oligo-dT

(CDSIII)请忽略此步骤，直接进行Step7]，25°C，室温孵育10 min。 7. 42°，孵育10 min。

注意: 孵育在热盖的PCR仪中进行。若用非热盖的PCR仪或水浴，请

在反应管中加入一滴矿物油来避免水分蒸发。

8. 加入 1 μl SMART III-modified oligo，混匀，42°C，孵育1 hr。

9. 75°C ，10 min终止第一链合成反应。

10. 室温冷却，加入1 μl RNA酶H (2U)。

11. 37°，孵育20 min。 12. 继续进行 LD-PCR 扩增(Section VII.B)。

注意: –20°C下可保存3个月。

第一链反应最终体积为 15μl 10 μl SMART III Oligo

(10 μM; 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’)

10 μl CDS III 引物

(10 μM; 5’-ATTG-d(T)30VN-3’)* 23个碱基

10 μl CDS III/6 引物

(10 μM; 5’-ATTG-NNNNNN-3’)

注意: N = A, G, C, or T; V = A, G, or C

50 μl 5’ PCR 引物

(10 μM; 5’-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’) 25个碱基

50 μl 3’ PCR 引物

(10 μM; 5’-GTATCGATGCCCACCC-3’)

酵母双杂交系统主要是从prey文库中筛选与已知蛋白(bait)有相互作用的蛋白(prey)。

第二链cDNA合成（LD-PCR）

尽量使用最小的循环数来得到3-6ug的ds cDNA。Table III 中最优

的循环数取决于对照小鼠肝脏RNA的起始量。最优循环数随着模板量、

物种的不同而变化。这个程序是经过优化适用于Advantage 2 聚合酶

1. 准备:

第一链cDNA (Section VII.A)

热盖PCR仪

2. 建立两管100ul的扩增体系，一个是实验组，另一个是对照组：

2 μl 第一链cDNA (Section VII.A)

70 μl 蒸馏水

10 μl 10X Advantage® 2 PCR缓冲液

2 μl 50X dNTP 混合物

2 μl 5’PCR 引物

2 μl 3’ PCR引物

10 μl 10X溶解液

2 μl 50X Advantage 2聚合酶混合物

3. 扩增程序:

95°C 30 sec

x Cyclesa

95°C 10sec

68°C 6 minb

68°C 5min

a 参考Table III设定PCR循环数。

b 扩增程序每过一个循环时延伸时间增加5 sec。例如，在第二轮循环

中，延伸时间应该是6min 和5sec，如此叠加。

4. 对每个样品取7 μl PCR产物，使用0.25 μg 的1kbladder DNA分子量

标记在1.2%的琼脂糖/ EtBr进行电泳进行分析。

注意: 如果实验样本没有出现图中所示的结果，请参考疑难解答指南

(Section X)。

5. 柱纯化(Section VII.C)后，可将ds cDNA在–20°C保存待用。

酵母双杂交系统主要是从prey文库中筛选与已知蛋白(bait)有相互作用的蛋白(prey)。

CHROMA SPIN +TE-400纯化柱纯化ds cDNA

1. 准备:

LD-PCR 扩增ds cDNA (Section VII.B; 若没有得到至少3 μg的ds cDNA，

请使用更多的循环数重新做LD-PCR扩增。)

醋酸钠 (3 M)

冰乙醇 (95–100%)

2. 每93ul的cDNA样品使用一个CHROMA SPIN TE-400 纯化柱(参见

Figure 4)。

颠倒纯化柱数次，重悬胶基质，直至均匀。

移除顶端帽子。

掰断柱底部的break away。 将柱放置在2ml 的收集管 (已提供)中。

注意: 构建一个文库需要消耗2个纯化柱。 4. 700 rpm，5 min离心，丢弃收集管和平衡液，之后让matrix半干。

注意:推荐使用悬挂转子或水平转子 。角转子很可能导致样本从柱的

侧面流下，而不是经过胶基质，造成纯化不一致。

4. 将将离心柱放在另第二个收集管中，然后，向胶基质平坦的表面上

方加入93ul的样本。

注意: 切勿让样本从纯化柱内壁流入。

5. 700 rpm，5 min离心，样本便流到了收集管中。

6. 将两次的纯化样本收集到一个离心管中，并用乙醇进行沉淀cDNA：

加入 1/10体积的3 M 醋酸钠。

加入2.5倍体积的冰乙醇 (95–100%)。

–20°C ，1 hr放置沉淀。

14,000 ，室温离心20 min。

弃上清。

14,000 rpm瞬时离心，去除残留的上清液。 空气干燥10 min。

7. 20 μl 去离子水重悬cDNA，用于酵母文库构建。(Section VIII).

注意: 这时候应该可以得到2–5 μg的ds cDNA。 回收效率>70%

酵母双杂交系统主要是从prey文库中筛选与已知蛋白(bait)有相互作用的蛋白(prey)。

建立Mate & Plate 文库

1． 准备:

参考Yeastmaker 酵母转化系统2操作步骤制备Y187感受态细胞。

20 μl ds cDNA (Section VII)— ds cDNA 的量在 2–5 ug。

SD 固体培养基（ …… 此处隐藏：1850字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……