RNA提取技术

“从RNA提取到荧光定量 从 提取到荧光定量PCR”解决方案 提取到荧光定量 解决方案 ―核酸纯化系统TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD

市场部

蒋彦波

2008年4月 武汉 2008年

RNA提取技术

RNA相关知识及提取原理 相关知识及提取原理 RNA提取流程 提取流程 特殊组织RNA的提取 的提取 特殊组织 RNA的评价、鉴定与保护 的评价、 的评价 TIANGEN公司 公司RNA提取产品选择指南 公司 提取产品选择指南

RNA提取技术

细胞中RNA的种类和含量 的种类和含量 细胞中不同丰度 高丰度 组织名称 肝脏 脾脏 心脏 大脑 中丰度 胚胎 肾脏 肺 膀胱 低丰度 骨 脂肪 高丰度 中丰度 低丰度 成纤细胞 人白细胞 酵母 拟南芥叶片 烟草叶片 玉米叶片 样品量 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 105 105 105 1mg 1mg 1mg 0.50.5-1μg 0.50.5-1.5μg 0.20.2-0.5μg 0.050.05-0.1μg 0-0.05μg 0.050.05-2μg 2-4μg AAAAAA 总RNA含量 RNA含量

RNase

rRNA

tRNA

AAAAAA mRNA

RNA提取技术

RNA提取的基本方法 提取的基本方法——裂解原理不同 提取的基本方法 裂解原理不同异硫氰酸胍/苯酚法 异硫氰酸胍 苯酚法细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解， 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋 白体上的蛋白变性， 白体上的蛋白变性，核酸释放 释放出来的DNA RNA由于在特定pH下溶解度的不同而 DNA和 由于在特定pH 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而 分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离 分别位于整个体系中的中间相和水相，

胍盐/β-巯基乙醇法 胍盐 巯基乙醇法盐酸胍裂解样本，抑制RNase的活性 盐酸胍裂解样本，抑制RNase的活性 RNase β-巯基乙醇变性蛋白

RNA提取技术

RNA提取的基本方法 提取的基本方法——吸附方法不同 提取的基本方法 吸附方法不同沉淀法 介质吸附吸附材料 硅基质 阴离子交换树脂 磁珠 纯化原理 高盐低pH值结合核酸 高盐低pH值结合核酸 pH 低盐高pH pH值洗脱 低盐高pH值洗脱 低盐高pH值结合核酸 低盐高pH值结合核酸 pH 高盐低pH pH值洗脱 高盐低pH值洗脱 磁性微粒挂上不同基团可 吸附并携带RNA 吸附并携带RNA

RNA提取技术

RNA相关知识及提取方法原理 相关知识及提取方法原理 RNA提取流程 提取流程 特殊组织RNA的提取 的提取 特殊组织 RNA的评价、鉴定与保护 的评价、 的评价 TIANGEN公司 公司RNA提取产品选择指南 公司 提取产品选择指南

RNA提取技术

样品前处理——实验材料的选择 样品前处理——实验材料的选择 ——

选择新鲜血液，不得超过4 选择新鲜血液，不得超过4小时选择新鲜、生长旺盛的组织 选择新鲜、

选择新鲜的幼嫩组织 选择处于生长旺盛的时期收集细胞

RNA提取技术

样品前处理——实验材料的保存 样品前处理——实验材料的保存 ——可将新鲜血液先进行红

细胞裂解，得到白细胞， 可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到白细胞， 然后加入一定量的TRNzol TRNzol, 70℃保存较长时间 然后加入一定量的TRNzol,-70℃保存较长时间

推荐使用专门的RNA样品 推荐使用专门的RNA样品 专门的RNA 储存液进行储存 储存液进行储存

液氮保存， 液氮保存，避免反复冻融 去掉培养基，加入一定量TRNzol 去掉培养基，加入一定量TRNzol ℃保存较长时间 -70 ℃保存较长时间

RNA提取技术

样品前处理——处理方式 样品前处理——处理方式 ——液氮研磨 匀浆或液氮研磨 应用红细胞裂解液处理 直接裂解或胰蛋白酶处理

RNA提取技术

样品前处理——常见问答 样品前处理——常见问答 ——

Q-1:样品量是否越多越好？最大量 样品量是否越多越好？ RNA RNA

预期得率 A-1:不是。在试剂盒规定内增加，若过度增加样品处理量会 不是。在试剂盒规定内增加， 得 影响RNA得率 影响RNA得率； 率 得率； 如增加样品起始量， 如增加样品起始量，则后续实验中各溶液量均要相应按比 例增加。 例增加。 实 得率

处理样品量

RNA提取技术

样品前处理——常见问答 样品前处理——常见问答 ——

Q-2:如何保证研磨过程和匀浆中RNA不被降解？ 如何保证研磨过程和匀浆中RNA不被降解 不被降解？ A-2:研磨过程要迅速，同时尽量避免外源RNA酶污染； 研磨过程要迅速，同时尽量避免外源RNA酶污染 酶污染； 匀浆过程中一定要保证组织和裂解液充分接触，尽量在 匀浆过程中一定要保证组织和裂解液充分接触， 匀浆前将组织低温切割成小块加入裂解液中， 匀浆前将组织低温切割成小块加入裂解液中，可确保 RNA不被降解。 RNA不被降解。 不被降解

RNA提取技术

细胞裂解--释放RNA 细胞裂解--释放RNA --释放异硫氰酸胍/酚 异硫氰酸胍 酚-TRNzol、TRNzol-A+总RNA提取试剂 、 - + 提取试剂 胍盐/β-巯基乙醇 RNAprep pure系列RNA提取试剂盒 pure系列 系列RNA提取试剂盒 胍盐 巯基乙醇— 巯基乙醇 独特配方-植物RNA提取试剂 独特配方 RNAplant植物 植物 提取试剂

RNA提取技术

RNA纯化与获得-- 纯化要求 纯化与获得-- 纯化与获得RNA纯化要求

纯化后不应存在对酶(如逆转录酶) 1 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质 蛋白质、 2 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度 排除DNA DNA分子的污染 3 排除DNA分子的污染

RNA提取技术

实验举例及注意事项

使用试剂(以TRNzol-A+为例) 使用试剂( TRNzol- 为例) 使用试剂盒(以RNAprep pure试剂盒为例) pure试剂盒为例 试剂盒为例) 使用试剂盒(

RNA提取技术

样品前处理、 样品前处理、细胞裂解 试剂 试剂盒

抽提

加入吸附柱

操 作沉淀 加去蛋白液 和DNase I

洗涤 漂洗 溶解RNA沉淀

溶解RNA沉淀 RNA RNA洗脱收集 RNA洗脱收集 获得RNA产物 获得RNA产物 RNA

RNA提取技术

TRNzol-A+试剂法提取 试剂法提取——加量 加量

样品处理量与加入的TRNzol-A+的量要对应 的量要对应 样品处理量与加入的 1ml TRNzol-A+对应： 对应： 对应 血液 0.3ml 动植物组织30-50mg 动植物组织 贴壁细胞： 贴壁细胞：每10cm2培养面积 悬浮细胞： 悬浮细胞：5-10×106细胞 ×