短小芽孢杆菌木聚糖酶基因的扩增及表达

短小芽孢杆菌木聚糖酶基因的扩增及表达

——分子生物学实验设计

马骏 刘怡 王艳丽 赵玮（周五314 1组 2组）

一：短小芽孢杆菌染色体DNA的提取：

1. 培养5mL细菌至饱和状态，取1.5mL培养物4000r/min 离心2min。弃上清。

2.沉淀物加入TE缓冲液567μL，用吸管反复吹打使之重悬。加入30μL10%的SDS和3μL20 mg/mL 的蛋白酶K，混匀，于37℃水浴1小时。

3.加入100μL 5 mol/L NaCl，充分混匀，再加入80μL CTAB/NaCl溶液，混匀，于65℃温育10min。

4.加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，离心12000r/min 4-5min，将上清液转入一个新的指管中（用扩口枪头）。

5.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，离心12000r/min 5min，将上清液转入一个新的指管中（用扩口枪头）。

6.加入0.6体积的异丙醇，轻轻混合至DNA沉淀下来，离心12000r/min 5min，弃上清，稍干燥，用1mL 70%的乙醇洗涤沉淀，震荡并离心5min，弃上清，空气中干燥。

7.加100μL TE缓冲液，存放4℃，过夜溶解。

二：引物设计：

根据NCBI文献报道的短小芽孢杆菌木聚糖酶基因序列，应用Primer Premier 5.0软件设计并分析引物如下：

PstⅠ

Primer 1:5’-GCTGCTGCAGAGGAGAGGAATGACGAATGA-3’

Bam HⅠ

Primer 2:5’-GCAGGATCCGACATGGTTCGTGTGCTGAAT-3’

其中引物1中含有PstⅠ酶切位点，该位点前面有4个保护碱基，引物2中含有Bam HⅠ酶切位点，该位点前面有3个保护碱基 。

FEATURES Location/Qualifiers

source 1..1011

/organism="Bacillus pumilus"

/db_xref="taxon:1408"

CDS 44..730

/codon_start=1

/transl_table=11

/product="endo-1,4-xylanase"

/protein_id="AAM08361.1"

/db_xref="GI:19919754"

/translation="MNLRKLRLLFVMCIGLTLILTAVPAHARTITNNEMGNHSGYDYE LWEDYGNTSMTLNNGGALSAGWNNIGNALFRKGRKFDSTRTHHQLGNISINYNASFNP GGNSYLCVYGWTQSPLAEYYIVDSWGTYRPTGAYKGSFYADGGTYDIYETTRVNQPSI IGIATFKQYWSVRQTKRTSGTVSVSAHFRKWESLGMPMGKMYETAFTVEGYQSSGSAN VMTNQLFIGN"

短小芽孢杆菌木聚糖酶基因的扩增及表达

BASE COUNT 317 a 216 c 223 g 255 t

ORIGIN

Primer 1 1 gagatgacag aattaaaagg atgaaaaagg agaggaatgg acgatgaatt tgagaaaatt 61 aagactgttg tttgtgatgt gtattggact gacgcttata ctgacggctg taccagccca 121 tgcgagaacc attacgaata atgaaatggg taaccatagc gggtacgatt atgaattatg 181 ggaggattat ggaaatacct cgatgacact caataacggc ggggcactta gtgcaggctg 241 gaacaatatc ggaaatgctt tatttagaaa agggagaaag tttgattcca ctagaactca 301 ccatcagctt ggcaacatct ccatcaatta caacgcaagt tttaacccag gcgggaattc 361 ctatctatgt gtctatggct ggacacaatc tccattagca gaatactaca ttgttgattc 421 atggggcacg tatcgtccaa caggagcgta taaaggatca ttttatgctg atggaggcac 481 atatgacatt tatgaaacaa cccgtgtcaa tcagccttcc attatcggga tcgcaacctt 541 caagcaatat tggagtgtac gtcaaacgaa acgtacaagc ggaacggtct ccgtcagtgc 601 gcattttaga aaatgggaaa gcttagggat gccaatgggg aaaatgtatg aaacggcatt 661 tactgtagaa ggctaccaaa gcagcggaag tgcaaatgtg atgaccaatc agctgtttat 721 tggcaactaa aaaagtcaaa gaaaagagcc gggagcaaaa ctcctggctt tttctatcat 781 aatttttcaa cttcgactct gccggaaaag aacgtcgcac caccgcccat atctgccaaa 841 cgatcaggtg tgaggccatt caccaaatgt tttttgcctt tttggtctgc ccataatccc 901 tgactgacaa caacaccaga taacacattt tgtccgactg acacgatcag ctcgcattct 961 cctcgatcat tcagcacacg aaccatgtcc ccatcttcaa tcgtctttct t

Primer 2

三：PCR基因扩增及电泳检测：

㈠1.按照以下次序，将各成分在0.5mL灭菌离心管中混合：

ddH2O 补至终体积（50μL-100μL）

10хPCR缓冲液 1/10体积

4种 dNTP 各200μmol/L

PstⅠ引物 1μmol/L

Bam HⅠ引物 1μmol/L

DNA模板 10ng/μL

Taq酶 1-5U

混匀，离心15秒，使反应成分集中管底，加50μL石蜡油封住溶液表面。

2.将此微量离心管放入已设置好程序的PCR自动热循环仪，进行扩增。程序如下：

①94℃预变性 2min

②94℃变性 30s

③52℃退火 1min

④72℃延伸 2min

⑤重复步骤②-④30次

㈡电泳检测:

取10μL 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。若在1kb 附近有一条很亮的扩增带，而没有明显的非特异条带，则符合预期结果。

短小芽孢杆菌木聚糖酶基因的扩增及表达

四：DNA重组：

1.在灭菌的Eppendorf管中加入pUC19质粒（购买）2μL，10ХK buffer 2μL , Bam HⅠ和PstⅠ各1μL，无菌水14μL，离心混匀，37℃反应3h。

2. 在另一灭菌的Eppendorf管中加入PCR产物6μL，10ХK buffer 1μL, Bam HⅠ和PstⅠ各1μL，无菌水1μL，离心混匀，37℃反应3h。

3.分别将酶解液加入1/10体积的3 mol/L KAc(Ph5.2)溶液，再加2倍体积的无水乙醇。-20℃，2h。12000 r/min 4℃离心15min，弃上清，加70%乙醇洗涤沉淀，再离心，去上清，干燥后，加5μTE缓冲液。

4.将酶切后的2个DNA片段混合于一管中，加入T4 DNA连接酶缓冲液1μL，T4 DNA连接酶1μL，14℃保温14h。

五：E.coli感受态的制备与转化：

1.在大肠杆菌JM109平板上挑取一个单菌落接于2mL LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。

2.取1mL菌液转接到一个含有50mL LB液体培养基的锥形瓶中，37℃振荡培养2-3h。

3.将菌液转移到50mL离心管中，冰上放置10min.

4.离心10min（4000r/min），回收细胞。

5.倒出培养液，将管倒置1min以便培养液流尽。

6.用冰冷的0.1mol/LCaCl210mL悬浮沉淀，立即放冰上保温30min。

7.0-4℃ 4000r/min，离心10min，回收细胞。

8.用冰冷的0.1mol/L CaCl2 2mL悬浮细胞，（务必放冰上）。

9.取200μL新鲜配制的感受态细胞，加入重组DNA5μL混匀，冰上放置30min。

10.将管放到42℃循环水浴1-2min。

11.冰浴2min。

12.每管加800μL LB液体培养基，37℃培养1h。

13.将适当体积的已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上，倒置平皿37℃培养12-16小时，出现菌落。

六：阳性克隆的筛选及酶活检测：

㈠阳性克隆的筛选

在麦康凯培养基平板上生长的具有氨苄青霉素抗性的白色转化子即为含有外源片段的重组子。 ㈡酶活检测

挑取白色菌落至5mL LB液体培养基的试管中，37℃慢摇过夜。取1mL菌液涂在含氨苄青霉素和燕麦木聚糖（ρ=2g/L）的LB选择培养基平板上，生长4小时后，用刚果红（ρ=1g/L）染色30分钟，再用NaCl（ρ=5g/L）脱色30分钟，含有木聚糖酶基因的阳性克隆可产生木聚糖酶，水解菌落周围的木聚糖形成透明的空斑，背景是红色。空斑的大小可以初步反映酶活的高低。

用0.02mol/L,pH 7.0磷酸缓冲液制备（ρ=10g/L）的溶液，加入适当的稀释酶液，50℃反应30分钟，终止反应后用DNS法测定OD540nm， 以木糖作为标准溶液，以每分钟生成1μmol还原糖作为1个酶活单位（1U）。这样就可以定量测得酶活的高低。

短小芽孢杆菌木聚糖酶基因的扩增及表达

教师点评

该实验设计较好地利用了 PCR技术，从细菌染色体基因组中获得木聚糖酶基因。但是PCR引物的设计还有些问题，pUC19本身有ATG起始密码子，ATG,CCT,GCA,GAG,GAG,AGG,AAT,GAC,GAA,TGA（下划线部分为引物的PstI酶切位点，前面是载体PstI酶切位点前面的序列，灰色底纹为目的基因的起始密码子），在外源基因插入表达时，读码框架发生改变，引起移码突变。对阳性克隆的筛选注意到利用木糖酶本身特有的一些酶学特征与性质，将其与传统的阳性克隆筛选方法结合起来，更有利于快速准确地检测出重组基因质粒。