核酸的分离与纯化华西医院实验医学科 分子诊断室 王军

背景

核酸是遗传信息的载体，是最重要的生 物信息分子，是分子生物学研究的主要 对象，因此核酸提取也成为了分子生物 学实验技术中的最重要、最基本的操作。 核酸提取亦是临床分子诊断最关键的操 作，直接关系到实验的成败与否，是临 床分子诊断容易发生问题步骤。

核酸的存在形式

DNA:细胞核DNP 线粒体 环状DNA

RNA:细胞质中，mRNA,rRNA, tRNA 通常与蛋白质结合，形成RNP

核酸的理化性质

DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水， 不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离 酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA 在水中为10g/L,呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中， DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%, 随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠 中的溶解度很大，比纯水高2倍。 RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在 0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。

核酸提取方法

核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、 多糖、脂肪等生物大分子物质分开。

核酸提取时应遵循以下原则: 1、保证核酸分子一级结构的完整性; 2、排除其他分子污染。

核酸提取方法

大多数核酸分离与纯化的方法一般都包 括：

细胞裂解、酶处理、核酸与其他生 物大分子物质分离、核酸纯化

每一步骤又可由多种不同的方法单独或 联合实现。

核酸提取方法——细胞裂解

细胞裂解可通过以下几种方法实现：

物理作用 化学作用 酶作用 (生物作用)

核酸提取方法——细胞裂解 ——物理作用：

包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、 冻融裂解和颗粒破碎等方法。这些方法 用机械力使细胞破碎,但机械力也可引 起核酸链的断裂,因而不适用于高分子 量长链核酸的分离。超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp 到 > 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。

核酸提取方法——细胞裂解 ——化学作用：

变性：加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或 强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍)

碱性PH环境：强碱(NaOH) 或碱性缓冲液 ( TE、STE 等)在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋 白质和多糖沉淀,核酸释放到水相；某些缓冲液中的一些金属离 子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子 Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被

降解。

核酸提取方法——细胞裂解 ——酶作用(生物作用):

主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、 植物蛋白酶或链酶蛋白酶) 以使细胞破裂,核 酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分 离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙 酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1 ,4) 键水解。 蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65 ℃及有EDTA、 尿素(1~4mol/ L) 和去污剂(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X100) 存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量 核酸的提取效率。

核酸提取方法——酶处理

在核酸提取过程中,可通过加入适当的 酶使不需要的物质降解,以利于核酸的 分离与纯化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或链酶蛋白 酶) 可以降解蛋白质,灭活核酸酶(DNase 和RNase); 或者加入DNase 或RNase 去除不需要的DNA或 RNA。

核酸提取方法——分离与纯化

——酚氯仿法

简介：1976,Stafford及其同事创立。现已经不断 改进。关键技术： 酚的使用

用酚来分离核酸首先是Kirty,1956年首次报道。 当时发现酚可以从水相中抽提蛋白质，使用阴离子 盐时，可以实现核酸分配在水相，而蛋白质在有机 相。

核酸提取方法——分离与纯化

——酚氯仿法

核酸提取方法——分离与纯化

——酚氯仿法 酚的准备 重蒸酚(去除可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA 的交联的醌类氧化物); 加入8一羟基喹咛，以防止酚氧化，(酚氧化发黄，而 氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交 联); 水饱和酚、平衡PH(大于7.8)(不饱和的酚能与15%其 提及的水互溶，从而降低水相中核酸产量) 发展和改进：

SDS取代阴离子盐 酚：氯仿混合液(增加了对糖、脂的溶解) 异戊醇的使用(减少泡沫、使RNase失活)

核酸提取方法——分离与纯化——酚氯仿法1. 2. 3.

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裂解缓冲液(异硫氰酸胍)处理 蛋白酶K消化，(根据需要亦可加入Dnase或RNAase) 50:48:2苯酚:氯仿:异戊醇混合液，与等量的裂解处理液混合，依据 应用目的,两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸) 或简单 颠倒混匀(适用于分离高分子量核酸) 后离心分离。疏水性的蛋白质 被分配至有机相,核酸则被留于上层水相。 转移水相，重复步骤3,直至满意为止。 核酸沉淀，在含核酸的水相中加入p H5. 0~5. 5 ,终浓度为0. 3M 的 NaAc 或KAc 后,钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷,在酸性环境 中促进核酸的疏水复性。然后加入2~3倍体积的预冷的无水乙醇,经 一定时间的孵育,可使核酸有效地沉淀。 14000g离心30分钟@室温，或者如果产量较大

可直接用玻璃钩子取 出。 70%乙醇洗涤2-3次，即可将沉淀溶于TE保存。

核酸提取方法——分离与纯化——酚氯仿法 纯度高，RNA回收效率极高，尤其是 <200bp的RNA,比如：siRNA,miRNA, mRNA和tRNA等 除核酸外，可提取蛋白质 耗时，繁琐，不利于自动化。

正式名称：异硫氰酸胍-酚-氯仿核酸提取法

By Piotr Chomczynski and Nicoletta Sacchi 1987