细胞工程在现代生物技术中的地位及其实践意义：

（1）改善农业生产技术——动植物品种改良，植物快速繁殖；

（2）保护生态环境——生物工业避免化学工业污染，名贵药物的细胞生产保护自然资源； （3）生物医药开发——免疫医药工业，基因工程药物生产。 细胞工程的核心技术：细胞培养与繁殖 目的：获得新性状、新个体、新物种

植物细胞工程：细胞培养技术、原生质体融合与培养技术、组织培养技术、亚细胞水平的遗传操作技术

植物细胞的全能性：植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。

White、Gautheret、Nobecourt被誉为植物组织培养的奠基人。

植物细胞工程的应用：种苗脱毒与快速繁殖、植物特殊倍性创造、培育植物新品种、体细胞杂交、次生产物生产、基础研究。 培养室的光照强度：2000-3000lx

外植体的选择：选择优良的基因型、取材、外植体大小、选择外植体的时期

外植体休眠的处理：低温或赤霉素

内生菌的处理：抗生素、取生长期旺盛的生长点、取茎尖不停地转接（被内生菌污染） 糖在培养基的作用：为细胞提供合成新物质的碳骨架；为细胞的呼吸代谢提供底物和能量；维持渗透压

生长素的生理作用：促进细胞生长和细胞分裂；诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力；形成愈伤组织，促进生根；与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。

细胞分裂素的生理作用：促进细胞的分裂和分化、诱导芽的分化、促进侧芽的萌发和生长、抑制衰老。

植物激素：是指在植物体内合成的、通常从合成部位运往作用部位、对植物的生长发育产生显著调节作用的微量小分子有机物。 生长素类（IAA）、细胞分裂素类（CTK）-6BA、赤霉素类（GA）、脱落酸（ABA）、乙烯（ETH） MS是光谱性培养基，N6用于单子叶植物的培养，B5多用于豆科植物。

愈伤组织：脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的松散的细胞团。 外植体：植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。 细胞分化：是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。

再分化：在离体条件下，当细胞脱分化以后，无序生长的细胞及其愈伤组织要重新进入有序生长进而形成再生个体的过程称为再分化。

极性：是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。 很多情况下，细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志。

植物的离体器官发生：是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。

体细胞胚（胚状体）：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞）。

体细胞无性系变异：把由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系，而把这些植株所表现出来的变异称之为体细胞无性系变异。

离体培养再生植株诱变方法：

物理诱变（X射线、γ射线、快中子、紫外线）；

化学诱变（烷化剂、碱基类似物、移码诱变剂）；转座子插入；离子束诱变。

体细胞变异的应用：创造育种材料培育新品种、遗传学研究、发育生物学研究、代谢研究。 植

物激素对植物的作用

植物激素是指在植物体内合成的、通常从合成部位运往作用部位、对植物的生长发育产生显著调节作用的微量小分子有机物。

在众多植物离体培养中证明，细胞分裂素和生长素对于细胞生长和分化具有同等重要的协同作用，它们的量与比值的不同配合，对细胞分化起着重要调节作用。

生长素的生理作用：促进细胞生长和细胞分裂；诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力；形成愈伤组织，促进生根；与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。

细胞分裂素的生理作用：促进细胞的分裂和分化、诱导芽的分化、促进侧芽的萌发和生长、抑制衰老

生长素/细胞分裂素的比值高，促进生根，反之则促进茎、芽的产生；此外，在离体条件下，如果用生长素和细胞分裂素处理的顺序不同，其作用也不一样：如果先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，则有利于细胞分裂而不利于细胞分化；反之则有利于细胞分化。如果两者同时处理，则可促使分化频率的提高

体细胞胚与合子胚比较

（1）合子胚在发育初期具有明显的胚柄，而体细胞胚一般没有真正的胚柄，只有类似胚柄的结构； （2）合子胚的子叶是相当规范的，可以作为分类的依据，体细胞胚的子叶常不规范；

（3）与相同植物比较，体细胞胚的体积明显小于合子胚，在一些贮藏物质的含量上也存在较大差异，并且体细胞胚不能有明显的脱水干燥过程；

（4）合子胚在胚胎发育完全进入子叶期胚以后，经过一系列的物质积累和脱水就进入休眠，而体细胞胚则直接形成植株，在不同的培养条件和植株种类中，形成植株的胚胎时期有所不同，一般在心形期以后的各个阶段均可直接发育成小植物。

离体培养下变异的特点

（1）变异的普遍性：多种植物离体培养都会发生变异；就单个变异体来讲，离体培养中变异性状往往是单一的，或少数几个性状的变异；同一培养体系的再生群体，变异又具有多样性。

（2）从表型上看，在不同植物类型中经常发生的变异主要是植株形态（株高、叶形、叶色等）、生长势、育性、某些抗性等性状的变异；从生理生化特性上看，容易出现同功酶谱、次生代谢的消长等变异；一些单基因控制的性状不仅发生隐形突变，也发生显性突变。

（3）嵌合性：嵌合性是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞，它是组织培养中常见的现象。实际上，愈伤组织在大多数情况下是一种具有不同染色体数和遗传变异程度不同的细胞组成的嵌合体，这些细胞各自进行不同步的分裂。

影响体细胞遗传与变异的因素

（1）供体植物：植物种内基因型间变异频率差异较大；以分生组织为外植体的再生植株体细胞变异频率很低；体细胞在活体内组织分化期间会出现多倍性。培养物的类型：原生质体培养的体细胞变异〉细胞培养〉组织器官培养；性细胞培养再生植株的变异要大于体细胞培养的植株；培养类型的变异是多样性的。

（2）培养基和培养方式：培养基激素浓度和不同激素配比对再生植株的染色体倍性有一定影响；培养基的物理状态以及培养类型引起细胞的变异。

（3）继代次数引起的体细胞变异：继代时间越长，继代次数越多，细胞变异的几率就越高。 植物细胞工程的中心内容：植物细胞和组织的离体培养。

离体无性繁殖：利用离体培养技术，将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，在短期内获得大量遗传性状一致的个体的方法，也称之为微繁、快

速繁殖。

离体繁殖的使用范围：

（1）用于加速某些难繁殖或繁殖速度很低的植物，或某些需要加速繁殖的特殊基因型；（ 2）用于自然繁殖极易感染病毒的植物；

（3）用于有性繁殖变异范围大而自然条件下又不易无性繁殖的植物。

单株无性系或单芽无性系：利用离体无性繁殖培养技术得到的植株群体来自一个单株或单芽，他们的遗传组成相同，称为单株无性系或单芽无性系。

植物脱毒：利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中浸染的病毒，生产健康的繁殖材料，叫植物脱毒。

愈伤组织用途：

（1）用继代培养的方式长期保存； （2）可以通过悬浮培养而迅速增殖，用作无性系； （3）用作原生质体培养，是原生质体的来源。

继代培养：是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。

繁殖系数：也叫繁殖率，指每块外植体在一个培养周期内增殖的倍数。

脱毒与快繁的意义：

（1）能够有效地保持优良品种的特性； （2）快速繁殖新品种，使优良品质迅速应用； （3）生产无病毒苗，防止品种退化； （4）节约耕地，提高农产品的商品率； （5）便于运输。 分生组织病毒含量低的原因：能量竞争、传导抑制、激素抑制、酶缺乏、抑制因子。 影响脱毒的因素：母体材料病毒侵染的程度；外植体的生理状态；起始培养的茎尖大小。 不定芽：从现存的芽以外的任何器官、组织上通过器官发生重新形成的芽称之为不定芽。 不定芽增殖特点： （1）繁殖系数高 （2）遗传稳定性较好，但继代次数有限。

生根培养：生根培养基一般要求降低矿物营养的浓度，提高生长素的浓度，具体应根据植物不同而定。 生产用苗的培育：炼苗—假植—定植—生产用苗。

促使试管苗生根的方法：浸泡的方法、生根粉（APT）浸泡、生根粉＋黑暗处理、嫁接法、放置滤纸桥法。 人工种子:

狭义的人工种子是指植物离体培养中产生的胚状体（包括体细胞胚和性细胞胚），包裹在含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。

广义的人工种子是在胚状体或一块组织（顶芽、腋芽）、一个器官（小鳞茎等）之外加上必要的营养成分（人工胚乳）后，用具有一定通透性而无毒的材料将其包裹起来，形成的与天然种子相似的颗粒体。

分类：根据包被的程度可将人工种子分为三大类：裸露的或休眠的繁殖体、人工种皮包被的繁殖体、水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体；根据繁殖体的类型可分为两类：体细胞胚人工种子、非体细胞胚人工种子。人工种子的 意义：

（1）在无性繁殖植物中，有可能建立一种高效快速的繁殖方法，它既能保持原有品种的特性，又可以使之具有实生苗的复壮效应；

（2）可以对优异杂种种子不通过有性制种而快速获得大量种子，特别是对于那些制种困难的植物更具有主要的适用意义； （3）对于一些不能正常产生种子的特殊植物材料如三倍体、非整倍体、工程植物等，有可能通过人工种子在短期内加大繁殖应用； （4）与田间制种相比，可以节省制种用地，且不受季节限制，可以实现工厂化生产，同时还避免了种子携带病原菌的危险； （5）与利用试管苗相比，可以避免移栽困难，且可以实现机械化操作，同时还便于储藏和运输。 人工种子的结构：人工种皮、体细胞胚、人工胚乳。

种质：是决定生物遗传性状，并将遗传信息从亲代传给子代的遗传物质。

种质库：是指以种为单位的群体内的全部遗传物质，它有许多个体的不同基因组组成，又称基因库。 种质资源：具有种质并能繁殖的生物体统称为种质资源或遗传资源。

花粉培养：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，接种在人工培养基上，使其发育和分化成为植株的过程。 为什么说花粉培养成为染色体工程遗传育种的一个有效途径 由于花药的染色体只有体细胞的一半，因此通过花药培养的植株是单倍性的。由于单倍体没有显性基因的掩盖作用，易于选择，并能在很短时间内获得纯和二倍体植株，因此在育种实践中有独特的优越性，花药培养也成为染色体工程遗传育种的一个有效途径。

花药培养的基本程序： 外植体选择 外植体（花蕾）的预处理 外植体消毒 剥取花药 接种 诱导培养 分化培养 移栽

低温处理的作用： （1）可以激发花粉母细胞产生两个相等核，而不是一个营养核和一个生殖核； （2）保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老； （3）激发花粉产生原胚； （4）促使细胞同步分裂。

花粉培养方法：花粉看护培养、条件培养、双层培养

原生质体：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。 原生质体特征：

（1）无细胞壁障碍，可以方便地进行有关遗传操作，并可以对膜、细胞器等进行基础研究； （2）具有全能性，并能进行人工培养发育成完整植株； （3）原生质体适合进行诱导融合形成杂种细胞。

亚原生质体：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体，它可以具有细胞核或没有细胞核。

核质体：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质，也称为微小原生质体。 胞质体：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。

原生质体培养：将植物的体细胞（二倍体细胞）经过纤维素酶等处理后去掉细胞壁，获得的原生质体在无菌培养基上生长、分裂，最终长成植物的方。 不同的材料采用不用的酶处理 双子叶（叶片）：纤维素酶+少量果胶酶；

愈伤组织、悬浮细胞：纤维素酶+半纤维素酶+果胶酶； 根尖细胞：果胶酶+（粗）纤维素酶； 花粉母细胞、四分体小孢子：纤维素酶+果胶酶+蜗牛酶； 成熟花粉：纤维素酶+果胶酶； 木本植物：纤维素酶+半纤维素酶+果胶酶； 酶处理条件：PH5.4~6.2；25~30℃；4~24h 悬浮培养：是将单个游离的单细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。 优点：

（1）增加培养细胞与培养基的接触面，改善营养供应；

（2）在震荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞产生毒害； （3）振荡培养可以适当的改善气体交换。

诱导疏松易碎愈伤组织的关键是：培养基中应有 （1）较高含量的无机氮源 （2）丰富的有机物质 （3）低浓度的蔗糖 （4）适当缩短继代培养的时间间隔 （5）转移接种时尽量将愈伤组织平铺于培养基表面。

一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：

（1）悬浮培养物分散良好，细胞团较小，一般在30-50个细胞以下；

（2）均一性好，细胞形状和细胞大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈新鲜的乳白或淡黄色；

（3）细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2-3天甚至更短时间便可增长一倍。

细胞同步化：是指同一悬浮培养体系是所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 同步化的方法：饥饿法、抑制剂法、分选法、低温处理法。

平板培养：是指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。

看护培养：其方法是在固体培养基上置入一块生长活跃的愈伤组织，再在愈伤组织上放一小片滤纸，待滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上，当培养细胞长出微小细胞团以后，将其直接转

移至琼脂培养基上让其迅速生长。

双层滤纸植板培养：在饲养层细胞 和靶细胞之间放两张滤纸，上面一层滤纸用于将靶细胞转移到其他培养基上继续培养。 细胞微室培养：将细胞或原生质体接种在培养板的微室中进行培养。

成批培养：是指在一个培养体积中接种细胞和添加培养基后，中途不在添加培养基也不更换培养基的培养方式。

连续培养：在培养过程中，不断向反应器中流加新鲜培养基，同时以相同的流量从系统中取出培养基，从而维持培养系统内在细胞密度、产物浓度以及物理状态的相对平衡，这种培养方式即称为连续培养。

半连续培养：它是一种介于成批培养和连续培养之间的培养方式，其基本方法是在完成成批培养的一个周期后，只从反映其中取出大部分细胞悬液，保留小部分细胞悬液作为下个培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养。

植物细胞规模培养：在离体条件下将植物愈伤组织或其他组织通过培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的方法。

植物生物反应器：是指利用植物的组织培养、细胞悬浮培养或整体植物工厂化大量产生具有重要功能的植物产品（疫苗、抗体、食物添加剂等）或快速繁殖植物的方法。

固定化植物培养生物反应器：通过凝胶包埋、表面吸附、膜固定等方法将植物细胞固定，是无菌培养液循环通过固定化细胞，生产植物次生代谢产品的方式。 植物次生产物的主要类型： （1）酚类化合物，包括黄酮类，醌类和简单酚类 （2）萜类化合物

（3）含氮化合物，主要包括生物碱、胺类、非蛋白质氨基酸和生氰苷。

体细胞杂交：两种异源（种、属间）原生质体在诱导剂诱发下相互接触，从而发生膜融合，质融合和核融合并形成杂种细胞，进一步发育成植物体，称为细胞融合，或体细胞杂交。 意义：克服植物有性杂交不亲和（受精前、受精后），打破物种之间的生殖隔离，扩大了遗传物质的重组范围。 原生质体融合类型：

（1）对称融合，即两个完整的细胞原生质体融合。

（2）非对称融合，即利用物理或化学方法使亲本的核或细胞质失活后再进行融合。 原生质体融合方法：

（1）自发融合，即细胞间胞间连丝的扩展和粘连造成的原生质体融合。

（2）诱发融合，即使用适当的融合剂等方法，将不同的原生质体聚集到一起，然后使其粘连，从而实现原生质体融合。（盐类融合、高Ca2+和高pH融合、PEG融合、PEG与高Ca2+和高pH融合、电融合）

用于细胞质或细胞核失活的方法：物理法常采用射线处理，如X射线，单粒子束等，能使细胞核失活；化学法，核失活-碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸，质失活-罗丹明（R-6-G）。

融合方法：盐类融合（NaNO3）、高Ca2+和高pH融合、PEG融合、PEG与高Ca2+和高pH融合、电融合 在电融合时，原生质体密度，最适宜的密度一般为2×104—8×104个／ml 体细胞杂种的鉴定

（1）形态鉴定：根据双亲的形态学形状观察进行鉴定

（2）细胞学见鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定、染色体原位杂交 （3）生化鉴定：同工酶鉴定

（4）分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记、SSR标记鉴定。 体细胞杂种的特点： 变异幅度大、非整倍性、双亲性状的共显性、偏亲现象

体细胞杂交技术的应用：获得新物种、获得新种质和新品种、转移细胞质基因控制性状。