实验蛋白质电泳

时间：2025-07-14

分子生物学实验：蛋白质SDS-PAGE电泳

实验

诱导表达蛋白的SDS-PAGE 电泳检测

分子生物学实验：蛋白质SDS-PAGE电泳

实验目的

了解SDS-PAGE电泳实验原理

掌握SDS-PAGE电泳实验操作灵活运用SDS-PAGE电泳方法检测蛋白质

分子生物学实验：蛋白质SDS-PAGE电泳

原

理

蛋白质的变性(样品制备) 强阴离子去污剂：十二烷基磺酸钠(SDS) 还原剂：二硫苏糖醇(DTT) 物理作用：加热变性的多肽与SDS结合因而带负电荷，并且多肽与SDS结合的量与多肽的分子量成正比， SDS多肽复合物的迁移率只与多肽的大小相关。借助已知分子量的标准参照物，可推算出多肽的分子量。

分子生物学实验：蛋白质SDS-PAGE电泳

实验原理

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联试剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺在有引发剂(如过硫酸铵)和增速剂(如N,N,N’,N’-四甲基乙二胺， TEMED)的情况下聚合而成的。丙稀酰胺的聚合通常是由化学催化或光化学过程完成的,常用过硫酸铵、过硫酸钾或核黄素来引发这个过程，用TEMED、3-二甲胺丙腈等作为聚合过程中的增速剂。

丙烯酰胺 N,N’-甲叉双丙烯酰胺

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实验原理

聚丙烯酰胺凝胶三维结构

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实验原理

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳，它由浓缩胶和分离胶两部分所组成。由于浓缩胶的堆积(浓缩)作用，可使样品(即使是稀释样品)在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度(或一定浓度梯度)的凝胶上进行分离。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离原理：浓缩效应电荷效应分子筛效应

分子生物学实验：蛋白质SDS-PAGE电泳

聚丙烯酰胺凝胶由通过N,N’-亚甲双丙烯酰胺交联的丙烯酰胺聚合链组成。形成的孔径随双丙烯酰胺：丙烯酰胺比率的增加而变小。当比率为1:29时，可分离大小相差只有3%的多肽。 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 (聚)丙烯酰胺% 15 10 7.5 5.0 线性分离范围(KDa) 12-43 16-68 36-94 57-212

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Tris-甘氨酸不连续缓冲系统积层胶(Tris Cl pH6.8),分离胶(Tris Cl pH8.8),电泳槽缓冲液(Tris-甘氨酸)的pH 值与离子强度均不同。

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最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由 Ornstein(1964) 和 Davis(1964) 设计的, 样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲液含 Tris- 甘氨酸 (pH 8.3), 分离胶中含 TrisHCl(pH 8.8)。系统中所有组分都含有0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值

均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。

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垂直板电泳仪

分子生物学实验：蛋白质SDS-PAGE电泳

SDS聚丙烯酰胺凝胶的制备制胶 1. 将密封硅胶框放在长板上，将短板与长板重叠，将两块玻璃板立起来使其底部接触桌面，用手夹住放入电泳槽内，短板面向身体，插入斜楔板到适中程度。

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1.安装膜具

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装封胶条，注意封胶条平面朝下，不能有裂口

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盖上凹玻璃

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