三、病原菌的分离和(一)鉴定A

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实验三 肠道菌的分离培养与鉴定 目的要求： 1.熟悉选择和鉴别培养基的原理； 2.了解大肠杆菌的主要培养特性； 3.熟悉大肠杆菌和沙门氏菌的常规鉴定 方法；

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基本原理 肠道菌大多为革兰氏阴性小杆菌， 采用一般染色和分离培养难以鉴别，故须 采用鉴别和生化试验培养方能鉴定。不同 种类的肠道菌，产生的酶类和活性不同， 在代谢过程中，产生分解产物和合成产物 各不相同，利用细菌的生化特性，以生物 化学的方法来鉴别细菌称为生化试验。

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细菌分离培养和移植应注意下列事项： 1.选择适当培养基和培养条件。分离培养 前应充分考虑所分离的细菌的特性，选择 适合其生长的培养基以及所需的气体与培 养温度(病原菌一般为37℃)等。 2.严格无菌操作、防止污染。培养基和一 切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火 焰，接种环必须经火焰彻底灭菌；操作完 毕后，防止再让培养基接触外界空气，接 种环通过酒精灯火焰灭菌。

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3.防止过热的接种环杀死需要分离培养的 细菌。接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓 取细菌材料，否则会将细菌烫死；另外， 还应注意防止已钓取菌料的接种环，不慎 通过火焰而将细菌杀死。 4.纯化分离菌。初代分离时若长出两种以 上菌落，应进一步挑选可疑菌落进行纯培 养。

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一、肠道菌的分离培养法 (一)需氧菌分离培养法 1.平板划线法 此法为最常用的细菌分离 培养方法，其原则在于使被检材料充分分 散，以便经过培养后得到单个菌落，并可 对菌落的形态、颜色、溶血与否等进行观 察。

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术式 右手似持毛笔的姿势持接种棒的塑料柄处， 将接种环伸人酒精灯火焰中烧至通红，再 缓慢将接种棒其余金属部分均加以烧灼， 准备蘸取材料；左手取琼脂平板，琼脂面 与水平面成45°角，接种环同培养基平面 也成45°角。靠近酒精灯火焰操作。

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方法 接种环经烧灼灭菌、冷却后，蘸取欲分离 材料少许，按图实5-2中所示的几种划线方 式，选择其中一种进行划线。注意不要划 破琼脂，不要划得太疏，不要过多重复划 线，以免形成菌苔。划毕，将培养基用皿 盖盖好，接种环烧灼灭菌，于皿底用蜡笔 标记被分离材料名称及日期，倒转置37℃ 恒温箱中培养。

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一.鉴别(或选择)培养 (一)麦康凯琼脂培养基分离培养 1.原理 在培养基中含有胆盐，可抑制大 部分革兰氏阳性菌(Gt)的生长，培养基含 乳 糖 ， 大 肠 杆 菌 能 分 解 乳 糖 ， 使 pH 下 降 (而中性红指示剂5.5--7.5,红--黄)形成红 色菌落，而沙门氏菌和志贺氏菌，不能分 解乳糖，菌落小而无色。

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2

.方法

将需要鉴别的肠道菌(大肠杆菌和沙门氏 菌)或含肠道菌的病料，在康凯琼脂培养 基上划线分离，37℃培养24h观察。使之得 到单个菌落。 3.结果 大肠杆菌在此培养基上形成红色 菌落，沙门氏菌形成无色或浅黄色菌落。

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(二)SS琼脂培养基分离培养 1.原理 此培养以中性红作批示剂，其中 还有胆盐硫代硫酸钠，构椽酸钠，煌绿等 等抑制G+ 的生长，对大肠杆菌了有一定的 抑制作用，只有少数生长。培养基中含有 乳糖，在大肠杆菌能分解乳糖，产酸，指 示剂显红色(5.0-7.4 红—黄),故大肠杆 菌呈红色菌落，而沙门氏菌不能分解乳糖， 没能使培养基变酸呈黄色菌落。

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2.方法：将待检肠道菌和病料在SS琼脂培 养基上划线分离置37℃培养24h观察。 3.结果：大肠杆菌呈红色菌落，沙门氏菌 呈浅黄色菌落。

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(三)伊红美兰琼脂培养基分离培养 1.原理 因大肠杆菌分解乳糖产酸，而伊 红美兰在酸性环境中二者结合成紫色或紫 黑色化合物，故大肠杆菌呈紫红色或紫黑 色化合物，并带有金属光泽的菌落。而沙 门氏菌不能分解乳糖，没能使培养基变酸 呈粉红色菌落。

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2.方法：将待检肠道菌在伊红美兰琼脂培 养基上划线分离37℃培养24h观察。 3.结果：大肠杆菌呈紫红色或紫黑色并 带有金属光泽的菌落而沙门氏菌呈粉红色 菌落。

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伊红美兰的结果

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(四)双糖铁(或三糖铁)琼脂培养基 分离培养 1.原理：在培养基中含乳糖、葡萄糖(或 蔗糖),在底部，大肠杆菌能分解全部糖。 底部游离氧较小，发酵不能达到最后产物， 因此，积累的酸类较多，故呈黄色。在上 部(斜面),虽然有充足的氧，但积累的 酸性产物仍然较多，故为黄色。