蛋白质的化学修饰

蛋白质分子量测定

蛋白质性质鉴定蛋白质分析鉴定是蛋白质研究中的一个最基本技术, 是确定蛋白质产品的是与非的问题,尤其是在研究新的蛋 白质组分时显得更重要。研究一个新的蛋白质首先要从它

的基本性质作为突破口，然后根据它的基本性质进行分离纯化，最终用纯品对其进行分析鉴定。如果对蛋白质的基 本性质尚未搞清楚，工作起来将会困难重重。因此，蛋白 质研究技术主要是对蛋白质的基本性质的进行分析鉴定。

蛋白质鉴定的主要参数蛋白质分子是非常复杂的生物大分子,能代表其特征参 数很多.但在普通实验室能够进行测定的、最常用的参数，

归纳起来主要有以下几种。(1)蛋白质的质量鉴定(分子量) (2)蛋白质带电性鉴定(等电点) (3)蛋白质结构鉴定(一、二级结构、晶体、肽谱、NC-末端) (4)蛋白质生物学功能鉴定(生物活性、比活、酶促动力学)

(5)免疫学鉴定(抗原-抗体反应、酶联免疫反应)

意义

确定分子大小 从氨基酸组成分析的结果求得准确的氨基 酸组成 验证已测定的一级结构是否正确

常用测定分子量的方法

SDS-PAGE 凝胶过滤层析 质谱 核磁共振

一、SDS-PAGE 测定蛋白质的相对分子量

【基本原理】 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率， 用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根 据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。 这种迁移率的不同，就蛋白质分子本身 而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形 状有关。

当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫 酸钠(SDS)时，则得电泳迁移率的大小只 取决于蛋白质的分子量，从而可推测蛋白 质的分子量。

SDS的作用原理SDS是一种阴离子去污剂，能够与蛋白 质结合，破坏蛋白质分子之间以及与其它物 质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改 变原有的空间构象。

蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子， 所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量，从而 消除了不同种类蛋白质间电荷的差异。 并且由于分子量越大的蛋白质结合的SDS越 多，所带负电荷也越多，这就使各蛋白质-SDS 复合物的电荷密度趋于一致。

同时，不同蛋白质的SDS复合物形状也相 似，均是长椭圆状。 因此，在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋 白质-SDS复合物的大小，也可以说是取决于蛋 白质分子量的大小，而与蛋白质原来所带电荷 量无关。

当SDS的总量为蛋白量的3~10倍且SDS 单位浓度大于1 mol/L时，这两者的结合是定 量的，大约每克蛋白质可结合1.4克SDS。

组成该电泳系统由两层不连续聚丙烯酰胺凝胶组成

上层胶:浓缩胶(stacking or concentration gel)浓 度 2-5%,

缓冲液pH值为6.8 下层胶：分离胶(seperation or resolving gel)

浓 度 5-20%,缓冲液pH值为8.3

特点 具有很高的分辨力，这是因为它具有以下三种效应：

▼样品浓缩效应A. 分离胶的阻力(孔径小),浓缩作用 B. 缓冲液离子成分的不同 [(甘氨酸离子 (慢)氯离子(快)],压缩作用 C .浓缩胶与分离胶之间pH值差(分离胶pH高， 调节慢离子的迁移率)

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分子筛效应 大分子运动慢，小分子运动快

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电荷效应带电荷多的运动快，带电荷少的运动慢