第14章基因重组和基因工程

第14章

基因重组和基因工程Genetic Recombination and Genetic Engineering

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第一节

自然界DNA重组和基因转移 是经常发生的DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature目录

第二节 重组DNA技术 又称DNA克隆或分子克隆DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone

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重组DNA技术的发展史1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传 工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的

药物。1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。

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本节主要内容： 相关概念

DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体

基本原理 重组DNA技术与医学的关系

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一、重组DNA技术相关概念(一) DNA克隆 克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷 贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning), 即无性繁殖。

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技术水平：分子克隆(molecular clone)(即DNA 克隆)

细胞克隆个体克隆(动物或植物)

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DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗 传物质(同源的或异源的、原核的或真核的、 天然的或人工的 DNA)与载体DNA接合成一具 有 自 我 复 制 能 力 的 DNA 分 子 —— 复 制 子 (replicon) ,继而通过转化或转染宿主细胞，筛 选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增 提取获得大量同一 DNA分子，也称基因克隆或 重组DNA (recombinant DNA) 。目录

生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶 工程、细胞工程等 基因工程(genetic engineering) —— 实现基因 克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，

又称重组DNA工艺学。 目的： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)目录

(二)工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ

逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶目录

重组DNA技术中常用的工具酶工具酶 功 能

限制性核酸内切酶DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ

识别特异序列，切割DNA催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 合成双链cDNA分子或片段连接 ② 缺口平移制作高比活探针 ③ DNA序列分析 ④ 填补3´末端①

Klenow片段

又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5 3 聚合、3 5 外切活性，而无5 3 外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3 末端标记等 合成cD

NA ② 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析①

反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶

催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基

限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 定义： 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其 周围切割双链DNA的一类内切酶。Bam HⅠ

GGATCC CCTAGG

G GATCC + CCTAG G

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分类： Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(基因工程技术中常用Ⅱ型) 作用： 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰

系统，限制外源DNA,保护自身DNA。

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命名：

Hin dⅢ属 系 株

Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 序

第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。

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Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)GGATCC CCTAGG 切口 ：平端切口、粘端切口

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HindⅡ

Bam HⅠ

GTCGAC CAGCTG

GGATCC CCTAGG

GTC GAC CAG + CTG

G + GATCC G CCTAG

平端切口

粘端切口目录

同功异源酶：来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。Bam HⅠ GGATCC CCTAGG BstⅠ G GATCC + CCTAG G

GGATCC CCTAGG

GATCC G + G CCTAG目录

同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端， 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍未端(compatible end)。Bam HⅠ GGATCC CCTAGG Bg lⅡ AGATCT TCTAGA

G + GATCC CCTAG G

A +GATCT A TCTAG目录

限制性内切核酸酶名 称 识别序列及切割位点 名 称 识别序列及切割点

切割后产生5’突出末端: BamHⅠ 5’…G▼GATCC...3’ Bgl Ⅱ 5’…A▼GATCT...3’ EcoR Ⅰ 5’…G▼AATTC...3’ Hind Ⅲ 5’…A▼AGCTT...3’ Hpa Ⅱ 5’…C▼CGG...3’ Mbo Ⅰ 5’…▼GATC...3’ Nde Ⅰ 5’…GA▼TATG...3’ 切割后产生3’突出末端: Apa Ⅰ 5’…GGGCC▼C...3’

Hae Ⅱ 5’…PuGCGC▼Py...3’ Kpn Ⅰ 5’…GGTAC▼C...3’ Pst Ⅰ 5’…CTGCA▼G...3’ Sph Ⅰ 5’…GCATG▼C...3’ 切割后产生平末端: Alu Ⅰ 5’…AG▼CT...3’ EcoR Ⅴ 5’…GAT▼ATC...3’ Hae Ⅲ 5’…GG▼CC...3’ Pvu Ⅱ 5’…CAG▼CTG...3’ Sma Ⅰ 5’…CCC▼GGG...3’

(三)目的基因(target gene) cDNA (complementary DNA)

指经反转录合成的、与RNA (通常指 mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以 单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双 链cDNA。 基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息 …… 此处隐藏：896字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……