基于免疫荧光法对人工红细胞膜骨架蛋白 spectrin

中国科技论文在线http://www.77cn.com.cn 基于免疫荧光法对人工红细胞膜骨架蛋白spectrin的

定位分析

王莹1，王翔1，李遥金2，刘峰1，肖科1，熊延连1

1重庆大学生物工程学院，重庆（400044）

2第三军医大学西南医院，重庆（400038）

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摘 要：本文建立免疫荧光方法对人工红细胞膜蛋白进行荧光定位，从膜结构蛋白角度分析本实验室构建的人工红细胞，也为血液代用品的评价提供了新的途径。以荧光标记兔抗人免疫球蛋白为抗体，采用间接免疫荧光染色法对红细胞膜蛋白spectrin αl原位标记，在激光共聚焦显微镜下以488nm蓝光激发荧光，通过对比天然红细胞和人工红细胞的spectrin分布，分析人工红细胞的构象和重建的过程。与天然红细胞类似，人工红细胞在膜上有血影蛋白分布，本实验荧光原位标记结果进一步揭示了人工红细胞的体外构建过程。

关键词：免疫荧光法；人工红细胞；血影蛋白；定位

中图分类号：Q2

1．引言

免疫荧光（Immunofluorescence，IFT）是作为一门新兴技术，具有灵敏度高、特异性好、显色特别、检测速度快和在细胞水平定位准确等传统技术不可比拟的优势，已在现代生物学和医学领域得到广泛应用[1-3]。

血影蛋白（spectrin）又称收缩蛋白，由α和β亚基构成，具有多个肌动蛋白连接位点。据[4-7]报道，血影蛋白能为膜双层结构提供力学支持并在成纤维细胞、神经细胞、肌细胞、淋巴细胞等中参与信号转导。血影蛋白是红细胞膜蛋白最主要的组成成分之一，约占膜提取蛋白总量的25-30%，在维持红细胞形态、保持细胞膜完整性以及调控红细胞携氧等方面发挥着至关重要的作用[8]。本课题组提出的基于细胞骨架的红细胞重建，以引入膜骨架蛋白使其自组装为特点，形成具有天然红细胞力学特性的人工红细胞。因此spectrin作为红细胞膜骨架主要蛋白，对其进行原位分析在人工红细胞膜结构鉴定中具有关键作用。

本文运用间接免疫荧光法，对天然红细胞和人工红细胞膜spectrin蛋白进行原位标记分析，旨在阐明人工红细胞和天然红细胞在形态及结构等方面的异同。

2．材料与方法

2.1实验材料

2.1.1 细胞来源 天然红细胞 来自查体合格的成年人外周血。

人工红细胞 实验室自制（具体方法见文献[9]）

2.1.2 抗体 兔抗人spectrin α l (H-110) 多克隆Ig G抗体购自美国SANTA CRUZ公司 ,标记异硫氰酸酯荧光素(FITC)的山羊抗兔多克隆Ig G抗体购自北京中衫金桥公司。

2.2 方法

2.2.1 细胞收集 天然红细胞 取全血100μl加入1 ml PBS缓冲液（pH 7.4）缓慢混匀，900r/min离心3min，弃上清。重复洗涤两次。收集红细胞备用。 本课题得到国家自然科学基金（No.10572159），重庆市科委科技计划项目攻关项目（No.2006ba5010），高等学校学科创新引智计划（No.B06023），重庆大学大型仪器设备开放基金资助。

涤两次。收集细胞备用。 人工红细胞 取人工红细胞悬液200μl 2000r/min离心5min，弃上清。PBS缓冲液重复洗

2.2.2 细胞的免疫荧光标记 天然红细胞 向样品加入500μl 2% PFA和500μl 0.0075%戊二醛，室温固定30min。等渗PBS洗涤一次，加入0.03 % Triton X-100 1 ml,处理1min，3700r/min离心5min，弃上清。PBS洗涤一次。5% BSA 1 ml室温封闭40min。spectrin抗体溶液（1：100）500μl室温摇床孵育4h，使抗体和红细胞spectrin特异位点充分结合。PBS洗涤两次，加入FITC标记的山羊抗兔荧光抗体(1:100) 500μl，室温摇床孵育1h后，PBS离心洗涤3次，弃上清，制成0.2 ml细胞悬液。

人工红细胞 除省去0.03 % Triton X-100处理步骤，其他操作过程均与天然红细胞相同。

2.2.3 观察 将样品滴片，于OLYMPUS IX71荧光显微镜（激发波长492nm，×100油镜）下观察结果。

将细胞涂片置于TCS SP5/Leica DMI6000型激光共聚焦显微镜上,使用488nm激光激发荧光进行检测,单层扫描图像从屏幕上显示后被照相机拍摄。

3．结果

用兔抗人spectrin α l为一抗 , FITC 偶联山羊抗兔 IgG为二抗进行间接免疫荧光标记实验。在荧光倒置显微镜和激光共聚焦显微镜下观察结果。图1-A为未经处理的天然红细胞在显微镜下直接观察的结果，可明显看出双凹碟盘状结构。经过2%PFA+0.0075%戊二醛固定和0.03 % Triton X-100处理后（见图1-B），细胞结构仍然保持完整，透明度增大。图1-C为荧光染色后红细胞，其绿色荧光信号细胞周缘明亮中间较暗，并且呈不均匀的点状分布。 图2分别为天然红细胞和人工红细胞经FITC染色后激光共聚焦单层扫描图像，其中A为明场，B为488nm氩离子激光激发荧光图像，C为叠加场。从图中可以看出，人工红细胞能与天然红细胞一样能够被spectrin α l抗体特异性荧光标记，天然红细胞绿色荧光信号在细胞周边呈点状明亮分布，人工红细胞荧光信号则比较均匀。天然红细胞大小比较均一，约为7-8μm，人工红细胞直径分布更广。

（a） （b） （c）

图1 天然红细胞spectrin α l荧光染色前后

Fig1 Immunofluorescence stained spectrin α l of natural RBC in front and behind

（a）离心纯化的天然红细胞（倒置相差显微镜）（b）经2%PFA+0.0075%戊二醛固定和0.03 % Triton X-100处理后的红细胞（倒置相差显微镜）（c）spectrin α l FITC标记红细胞结果（间接法 倒置荧光显微镜） （a） …… 此处隐藏：6623字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……