海藻酸钠固定化β-葡萄糖苷酶的制备及其性质研究

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第3 0卷第 1 0期20 0 7年 1 0月

合肥工业大学学报 (自然科学版)J OURNAL 0F HEF EIUNI VERSI 0F TECHNOLOGY TY

Vo. 0 No 1 13 . 0Oc . 2 0 t 07

海藻酸钠固定化』葡萄糖苷酶的制备及其性质研究 3一潘利华，罗建平，查学强，王贵娟，李想 (合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥 200) 3 0 9

摘

要：在活性炭、明胶等 8种固定化载体筛选的基础上研究了以海藻酸钠为载体，二醛为交联剂固定化戊

葡萄糖苷酶的条件，对固定化酶的酶学性质及其在催化制备大豆异黄酮活性苷元染料木素中的应用进行并了研究。B葡萄糖苷酶在 0 2戊二醛溶液中交联 2h后再与 2/ _ .0 0g L海藻酸钠混合，后逐滴加到 4g L然/ C C2 a1溶液中，固化 1h后过滤、 洗涤得固定化葡萄糖苷酶，固定化酶的酶活回收率为 8. 7。固定化酶的 3 6最适温度、热稳定性、 H值稳定性以及与底物的亲和力都有所提高，适 p值基本不变。该固定化酶重复 p最 H使用 6次后其活力仍保持 9 . 4, o 9 染料木苷转化率达 6 .2。 o o 关键词：_ B葡萄糖苷酶；海藻酸钠；固定化酶；染料木素中图分类号： TQ9 5 2文献标识码： A文章编号：03- 6 (07 l一3 10 1 0一0 0 2 0 )O13—5 5

P eaai n rpri f o i agn t i rp rt nadpo et s du liae mmo izd[g cs ae o e o s m - bl e I l oi s i -u dP i u, L i - ig Z AN L— a UO J npn, HA eqa g WANG Gu- a, L a g h a Xu -i, n iu n j I n Xi( c o 1 fBit c n lg n oo gn eig,H ee ie st fTe h oo y,Hee 3 0,Chn ) S h o o e h oo y a d F d En ie rn o fiUn v riyo c n ig fi2 0 09 ia

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葡萄糖苷酶 ( C .. . 1, E 32 12 )又称[I葡萄}) __糖苷葡萄糖水解酶，能够水解结合于末端非还它

生产的关键酶。此外，_萄糖苷酶对植物防御[葡}害虫具有积极作用，而应用 f葡萄糖苷酶的转糖} _

原性的 p )—_ I葡萄糖苷键，同时释放出 I葡萄糖 ) _和相应的配基。葡萄糖苷酶是纤维素酶系中的 一

个组成部分，在纤维素降解中发挥重要作用。

苷作用生产非离子表面活性剂具有广阔的应用前景。但是 G葡萄糖苷酶市场价格昂贵、用寿命使和储存期短，因而在实际应用过程中受到一定的限制。

在食品i业中，葡萄糖苷酶为食品风味酶可用 于果汁、果酒及茶的增香，并且是天然色素枝子蓝

葡萄糖苷酶作为生物催化剂用于工业化生

收稿日期：0 61— 9修改日期：0 61—6 2 0—00; 2 0—02基金项目：安徽省自然科学基金资助项目(5 4 0 0 )合肥工业大学科学发展基金资助项目( 50 1 ) 00131; 030F作者简介：潘利华 (9 3,,黎川人， 1 7一)女江西合肥工业大学讲师； 罗建平 (9 6,, 1 6一)男安徽合肥人，合肥工业大学教授，博士生导师.

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产将依赖于酶的固定化。随着固定化酶技术的发

溶液中，固化 1h后取出， p值为 5 0醋酸缓 用 H .冲溶液冲洗 3次，制得直径约 3mm的固定化酶。 每个试验重复 3,平均值。固定化酶于 4℃次取

展，固定化载体种类越来越多，已报道作为固定化 f葡萄糖苷酶的载体有葡聚糖，丝素蛋白【,} -蚕 2] DuleA 5 8树脂 _, H值两性载体 E da i oi -6 t 3p] u rgtS 1 0铂纳米碳管[。葡聚糖固定化 J葡萄糖 -0 E和 5] 3一

冰箱甘油中保存备用，用前用 p值为 50醋

使 H .酸缓冲溶液冲洗 3次。1 3大豆异黄酮活性苷元染料木素的制备 . 0 1mg mI染料木苷 ( ./ 甲醇配制 ) . 0 5mL溶

苷酶酶活力回收较低，到 7;素膜因载体不 O丝膜的屏障作用而使固定化酶与底物的亲和力降低； D oi 5 8 E d a iS 1 0以及纳米碳而 u leA-6、 u rgt r 0 t

液与 p值为 50醋酸缓冲溶液 15mL混匀， H . .然后加入 0 5g固定化酶， 5 C下反应 3 n后加 . 4 0mi

管等载体制备费用较高。因此，文探讨采用安本全无毒、廉易得的海藻酸钠对葡萄糖苷酶进价行固定化，并研究固定化酶的酶学性质及其在催

入 3 mL甲醇终止反应。反应物于 4 5℃减压蒸干，用 1 mL色谱纯甲醇溶解，解物经再 溶

化生产大豆异黄酮活性苷元染料木素中的应用。

02 m膜过滤后进行 HP C1分析酶解产物 .2肛 L[] 4染料木素生成量，计算转化率 (以染料木素的转化

l材料与方法1 1主要试剂 .

生成率为指标 )。每次反应后，固定化酶取出，将 缓冲液洗涤后重复使用，进行 6次染料木苷水共解试验。

葡萄糖苷酶 ( lc Fu k公司 )用 p值值为， H 5 0醋酸缓冲溶液配成 2 mL酶液 . . 5U/ 4℃保存备用；硝基苯酚一萄糖苷 ( - G,Sg 对一葡 pNP ima公司)染料木苷和染料木素 (谱纯，,色上海同田生化技术有限公司 )。

1 4酶活力的测定 .

取酶液 0 5mL或 0 5g固定化酶于试管中， . . 加入 p值为 5 0醋酸缓冲溶液 1 5 mL和 H . .5mmo/ lL的 pNP . - G 0 5 mL 4℃恒温反应，5

12[葡萄糖苷酶的固定化 .} I活性炭法、明胶法、聚丙烯酰胺法、壳聚糖法、 海藻酸钠法、琼脂法、树脂法以及卡拉胶法分别参

3 n 0mi。反应结束后立即加入 2 mL的 0 5mo/ NaC溶液终止反应 ( . lL O。固定化酶活力测定时在终止反应前先将固定化酶取出)再加水，到 1 测吸光值 OD。。加热失活的酶液为 2mI, 4。空白对照。

考文献[~1] 6 3进行。 海藻酸钠法

优化试验方案设计如表 1所列。 』海藻酸钠质量浓度 (/ ) B为戊二醛体积 A为 gL,分数 ( ) C为 C C质量浓度 (/ )D为交联 , a1 gI,时间 ( ) h。表 1 L 64 )交试验因素水平表 1{正

酶活力的定义为在上述测定条件下，分钟每释放出 1> l硝基苯酚所需要的酶量为一个 mo对一酶活力单位 (。 U)固定化酶活力回收率一(固定化酶活力÷投入的游离酶活力 ) 0。×1 0

2结果与分析21 .葡萄糖苷酶固定化方法的选择

不同固定化方法对 f葡萄糖苷酶活力回收影} 1响如表 2所列。

由表 2可以看出，藻酸钠和琼脂两载体固海海藻酸钠法操作如下：5mL酶液加入一定 2

质量浓度等体积戊二醛溶液中交联一定时间后，加入到 1 0mL一定质量浓度海藻酸钠溶液中， 0

定化[} I葡萄糖苷酶酶活力回收相对较高，但是琼脂的熔点低，而大多数葡萄糖苷酶酶活的最适温度在 5 O℃左右，故选用海藻酸钠为最适载体， 进行葡萄糖苷酶固定化研究。

搅拌均匀；注射器吸取混合液逐滴滴入 C C用 a1

表 2不同固定化方法对 8葡萄糖苷酶活力回收的影响 一

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22 l葡萄糖苷酶固定化条件的确定 . 3一根据单因素试验结果 (据未显示 )按照表数， 1的设计进行 l葡萄糖苷酶固定化条件的优化， 3一结果如表 3所列。 表 3差分析结果表明，响海藻酸钠固定极影

时间、二醛体积分数、藻酸钠质量浓度。戊海

C Cz a 1质量浓度、海藻酸钠固定化 l 3一葡萄糖苷酶的最佳组合为 Az=, 2/海藻酸钠、 Bz{即 0gL C Dz0 2戊二醛、/ C C 2交联 2h .0 4g L a 1,。

最优条件下对 l葡萄糖苷酶固定化的试验结 3~果显示，酶活力回收达 8 . 7 3 6%。

化葡萄糖苷酶活力回收的主次因子依次为交联

表 3固定化条件优选 L 64正交试验结果 1( )

2 3固定化』葡萄糖苷酶的酶学性质 . 3一 2 3 1酶反应的最适温度和最适 p值

.. H在 p值为 50条件下，固定化酶和游离 H .将酶分别置于不同温度中测定活力，以各自的最高酶活力为 10, 0其结果如图 1示。所

围内稳定。实验过程中发现，0℃时， 8固定化酶

的强度降低，出现变形现象，可能导致蛋白质分这子从凝胶中游离出来，因此酶活力急剧降低。在各自最适反应温度下，固定化酶和游离将

酶分别置于不同 p值的缓冲溶液中测定活力， H

以各自的最高酶活力为 10,结果如图 2 0其所示。

∥℃

图 I温度对酶活的影响p H值

图 1表明，离酶的最适反应温度为 5℃;游 0 而固定化酶的最适温度为 6 0℃, 4￣7在 0 0℃范

图 2 p值对酶活的影响 H

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图 2表明， H值对固定化和游离酶活力的 p

通过双倒数作图法可得固定化酶和游离酶的米氏常数 K分别为 1 2 1 mo/和 8 0× . 2× 0 lL .1

影响基本相似，者的最适反应 p值分别为两 H5 5和 5 0 . .。试验过程中发现，固定化载体在 p H值大于 6 0的体系中球形结构会逐渐被破坏， H . p值为 7 0时已部分溶解， .酶被释放。2 3 2酶的热稳定性和 p值的稳定性 .. H

1 mo/。固定化酶的 K值较小，明固定 0 lL说化酶与底物的亲和力较游离酶大，这对反应是有利的。

将保存在 p值为 50冲溶液中的固定化 H .缓酶和游离酶同时分别于不同温度下保温 1h后，

在各自反应最适温度和最适 p值条件下测定剩 H余酶活力，以各自的最高酶活力为 10, 0结果如图 3示。可以看出，_所 f葡萄糖苷酶经固定化后，} 提高了对热的抵抗能力。

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图 4酶的 p值稳定性 H

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图 3酶的热稳定性

将固定化酶和游离酶于 5 C、同 p值的 0。不 H缓冲溶液中保温 1h后，各自反应最适温度和 在i]× 1/ mo。 s。 0 ( L l、图 5固定化酶和游离酶的 K

最适 p值条件下测定剩余酶活力， H以各自的最高酶活力为 10, 0 其结果如

图 4所示。 图 4显示，与游离酶相比，固定化酶的 p值 H

2 3 4固定化酶的储存稳定性 . .

稳定性有较大的提高，可能与 H这在载体与酶问的分配有关。

将固定化酶于 4。 C和室温保存，时取样，定测定固定化酶的酶活如表 4所列。表 4结果显示，

2 3 3酶的米氏常数 K ..取不同质量浓度 pNP分别加入固定化酶 - G,

室温保存时，定化酶活力随着保存时问的延长固而逐渐降低，存 1贮 5d前，固定化酶的活力变化

和游离酶，于各自最适温度、最适合 p值条件下 H测定两种酶水解 pNP的反应初速度， - G根据酶催

较小，存至 2,贮 5d相对酶活为 7 .; C存 3 1 4。保时，固定化酶活力损失不明显。可以认为，固定该化酶的储存稳定性较好。

化底物的E 2 -关系如图 5示。 s 1) I所

表 4固定化 8葡萄糖苷酶的储存稳定性 _

2 4固定化 f葡萄糖苷酶的应用 .} _以固定化 f葡萄糖苷酶为催化剂，} _考察固定

化酶催化染料木苷转化生产染料木素活性苷元的 能力如图 6示。图 6明，验条件下，固所表在试该