2010研究生免疫组织化学染色技术
时间:2025-07-11
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免疫组织化学实验技术武汉大学病理系 杨飞
武汉大学病理教研室
免疫组织化学技术的定义
免疫组织化学技术 (Immunohistochemistry, IHC)是用标记 的特异性抗体(或抗原)对组织内的抗 原(或抗体)的分布进行定位、定性、 定量检测,经过组织化学呈色反应在组 织原位显示抗原(或抗体),如各种蛋 白质、多肽、磷脂和多糖等成分的一门 新技术。武汉大学病理教研室
免疫组织化学的应用IHC通过检测细胞内、细胞表面或细胞 间的正常或异常的物质,以研究组织细胞的 正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理, 广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的 检测,细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表 型分析、细胞增殖和凋亡的研究,以及细胞 周期和信号转导的研究等。武汉大学病理教研室
实验名称链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法)
检测胃癌组织CK/Vimentin的蛋白表达
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S-P法原理示意图过氧化物酶 链酶亲和素 生物素 生物素化二抗
特异性一抗 待测抗原
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免疫组织化学基本实验流程组织、细胞标本 抗原修复 阻断内源性过 氧化物酶 正常血清封闭
滴加二抗
滴加特异性一抗
滴加三抗
显色
复染
封片 武汉大学病理教研室
具体步骤如下: 1.石蜡切片二甲苯脱蜡,梯度酒精水化,以0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5min; 2.所有组织均采用微波修复抗原; 4.滴加50μl过氧化物酶阻断液(试剂A),37℃湿盒 孵育 10min;
3.室温冷却后,0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5min;
5.0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5min;6.滴加非免疫性动物血清(试剂B),37℃湿盒孵育 10min;武汉大学病理教研室
7.甩去多余血清,分别滴加2种抗体,4℃湿盒孵育 过夜, 0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5min;8.滴加生物素标记的二抗(试剂C),37℃湿盒孵育 15min,0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5min; 9.滴加链亲和素-过氧化物酶溶液(试剂D),37℃湿盒孵 育 15min, 0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5min ; 10.每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺(DAB)显色液, 光镜下控制反应时间(约为1-5min),自来水充分冲洗, 苏木素复染; 11.常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析; 12.阳性对照采用已知阳性片为标准,阴性对照采用PBS取 代第一抗体,其余步骤相同。
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实验流程中的注意事项
内源性过氧化物酶的灭活血清封闭
冲洗抗体选择及一抗孵育时间 检测及显色系统 复染
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染色前处理 -取材、脱水、浸蜡
组织及时固定固定剂选择:10%中性缓
冲福尔马林 4%多聚甲醛
常规下固定8-24小时 取材厚度:2mm
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染色前处理-预防脱片
常选用多聚耐氨酸(poly-L-lysine) 注意:1)应严格控制使用次数
2)玻片洁净度
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染色前处理 -包埋与切片
包埋:选择低熔点石蜡,温度不超过62℃
切片:厚度 3-4μm烤片:温度60℃,时间1小时;或60℃2小时 (迈新);或60℃过夜武汉大学病理教研室
染色前处理 -切片保存
切片不宜长时间在常温下保存
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染色前处理
-脱腊
原则:免疫组化的脱蜡试剂应与常规HE 脱蜡分开
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实验操作中的应用
抗原修复 实验操作中的注意事项
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抗原修复
影响染色结果的最关键因素 抗原修复方法分类1)酶消化法
2)加热法(高压法 水煮法 微波法)
抗原修复液的选择1)柠檬酸盐缓冲液(PH 7.2-7.4) 2)Tris(PH 7-8) 3) EDTA(PH 8.0) 武汉大学病理教研室