2010研究生免疫组织化学染色技术

时间：2025-07-11

免疫组织化学实验技术武汉大学病理系杨飞

武汉大学病理教研室

免疫组织化学技术的定义

免疫组织化学技术 (Immunohistochemistry, IHC)是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内的抗原(或抗体)的分布进行定位、定性、定量检测，经过组织化学呈色反应在组织原位显示抗原(或抗体),如各种蛋白质、多肽、磷脂和多糖等成分的一门新技术。武汉大学病理教研室

免疫组织化学的应用IHC通过检测细胞内、细胞表面或细胞间的正常或异常的物质，以研究组织细胞的正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理，广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测，细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡的研究，以及细胞周期和信号转导的研究等。武汉大学病理教研室

实验名称链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法)

检测胃癌组织CK/Vimentin的蛋白表达

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S-P法原理示意图过氧化物酶链酶亲和素生物素生物素化二抗

特异性一抗待测抗原

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免疫组织化学基本实验流程组织、细胞标本抗原修复阻断内源性过氧化物酶正常血清封闭

滴加二抗

滴加特异性一抗

滴加三抗

显色

复染

封片武汉大学病理教研室

具体步骤如下： 1.石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5min; 2.所有组织均采用微波修复抗原； 4.滴加50μl过氧化物酶阻断液(试剂A),37℃湿盒孵育 10min;

3.室温冷却后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5min;

5.0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5min;6.滴加非免疫性动物血清(试剂B),37℃湿盒孵育 10min;武汉大学病理教研室

7.甩去多余血清，分别滴加2种抗体，4℃湿盒孵育过夜， 0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5min;8.滴加生物素标记的二抗(试剂C),37℃湿盒孵育 15min,0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5min; 9.滴加链亲和素-过氧化物酶溶液(试剂D),37℃湿盒孵育 15min, 0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5min ; 10.每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺(DAB)显色液，光镜下控制反应时间(约为1-5min),自来水充分冲洗，苏木素复染； 11.常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析； 12.阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采用PBS取代第一抗体，其余步骤相同。

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实验流程中的注意事项

内源性过氧化物酶的灭活血清封闭

冲洗抗体选择及一抗孵育时间检测及显色系统复染

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染色前处理 -取材、脱水、浸蜡

组织及时固定固定剂选择：10%中性缓

冲福尔马林 4%多聚甲醛

常规下固定8-24小时取材厚度：2mm

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染色前处理-预防脱片

常选用多聚耐氨酸(poly-L-lysine) 注意：1)应严格控制使用次数