β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及表达

时间：2025-07-14

华南理工大学学报（自然科学版）

第３６卷第１２期２００８年１２月

ＪｏｕｍａｌｏｆＳｏｕｍＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ）

Ｖ０１．３６Ｄｅｃｅｍｂｅｒ

Ｎｏ．１２２００８

文章编号：１０００—５６５ｘ（２００８）１２一０１１２—０４

卢一ｌ，４一葡聚糖内切酶基因的克隆及表达水

郭成栓

崔堂兵＋

郭勇

（华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州５１０００６）

摘要：从一株产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌菌株Ｈ９中，克隆到了编码葡聚糖内切酶

的基因，对其基因序列及酶的结构域进行了分析预测，同时将该酶的基因构建于大肠杆菌

表达载体ｐＥ他０ｂ中，获得重组表达载体ｐＥ他ｏｂ－％ｆＡ，转化至大肠杆菌菌株Ｂ１２ｌ（ＤＥ３）

中进行表达，并进行十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳检测．实验结果表明：该基因大小为１９８０ｂｐ，共编码６５９个氨基酸，在大肠杆菌中得到了良好的分泌表达；该酶的相对分子质量约为７３０００，由两个不连续的结构域组成，其一为Ｎ一端催化结构域，由糖基水解酶家族９组成，其二为ｃ．端底物结合结构域，由碳水化合物绑定结构域家族３组成，其在不同温度和ｐＨ值下的活力和稳定性与原始菌株的比较接近．

关键词：葡聚糖内切酶；大肠杆菌；短小芽孢杆菌；基因；克隆；表达

中图分类号：Ｑ７８文献标识码：Ａ

．

碱性纤维素酶是一种可以在碱性条件下发挥催化作用的届一１，４．葡聚糖内切酶，广泛应用于洗涤剂、脱墨等行业¨４ｊ．洗涤剂中加入酶制剂，一方面可去除棉纤维上的污垢，另一方面还能起到使棉织物颜色鲜明和柔软的效果．与酸性纤维素酶不同，碱性纤维素酶是一种缺少葡聚糖外切酶和葡萄糖苷酶的非全组分的内切葡聚糖酶，不能发生酶组分间的协同效应．届．１，４一葡聚糖内切酶主要对棉纤维中占１０％左右的非结晶区（无定形区）的纤维素分子起作用，对结晶区纤维素水解活力很低，所以并不会明显降低棉纤维的牢固度．从自然界中筛选高活力口－１，４一葡聚糖内切酶产生菌，克隆其基因并利用强启动子进行表达是提高酶产量的重要措施．目前，虽然已有一些届－１，４一葡聚糖内切酶基因被克隆并同时也得到了表达，但表达活力大部分较低．本研究应用ＰｃＲ技术从一株短小芽孢杆菌Ｈ９中克隆了编码口．１，４一葡聚糖内切酶的基因，并将该基因构建在大肠杆菌

中得到了良好的表达．

１材料与方法

１．１

材料

短小芽孢杆菌菌株Ｈ９分离于土壤中，大肠杆

菌表达载体ｐＥ他０ｂ购于Ｎｏｖａｇｅｎ公司．

ＬＢ培养基＂ｏ的组成为：１％蛋白胨，１％Ｎａｃｌ，０．５％酵母膏，ｐＨ＝７．Ｏ，将其于１２１℃灭菌２０ｍｉｎ后备用．

限制性内切酶、连接酶、呦酶、ｐＭＤｌ８Ｔ载体及

蛋白相对分子质量标准物购于ＴａＩ（ａＲａ公司；羧甲基纤维素（ｃＭＣ）购于ｓｉｇｌＩｌａ公司；ＤＮＡ梯度标记物购于耵ＡＮＧＥＮ公司；胶回收试剂盒购于ＱＩＡＧＥＮ公司；引物由ｓａｎｇｏｎ公司合成；其他试剂均为国产分析纯．

１．２

方法

ＤＮＡ的提取采用十二烷基磺酸钠一蛋白酶Ｋ一