华南理工大学学报（自然科学版）

第３６卷第１２期２００８年１２月

ＪｏｕｍａｌｏｆＳｏｕｍＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ）

Ｖ０１．３６Ｄｅｃｅｍｂｅｒ

Ｎｏ．１２２００８

文章编号：１０００—５６５ｘ（２００８）１２一０１１２—０４

卢一ｌ，４一葡聚糖内切酶基因的克隆及表达水

郭成栓

崔堂兵＋

郭勇

（华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州５１０００６）

摘要：从一株产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌菌株Ｈ９中，克隆到了编码葡聚糖内切酶

的基因，对其基因序列及酶的结构域进行了分析预测，同时将该酶的基因构建于大肠杆菌

表达载体ｐＥ他０ｂ中，获得重组表达载体ｐＥ他ｏｂ－％ｆＡ，转化至大肠杆菌菌株Ｂ１２ｌ（ＤＥ３）

中进行表达，并进行十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳检测．实验结果表明：该基因大小为１９８０ｂｐ，共编码６５９个氨基酸，在大肠杆菌中得到了良好的分泌表达；该酶的相对分子质量约为７３０００，由两个不连续的结构域组成，其一为Ｎ一端催化结构域，由糖基水解酶家族９组成，其二为ｃ．端底物结合结构域，由碳水化合物绑定结构域家族３组成，其在不同温度和ｐＨ值下的活力和稳定性与原始菌株的比较接近．

关键词：葡聚糖内切酶；大肠杆菌；短小芽孢杆菌；基因；克隆；表达

中图分类号：Ｑ７８文献标识码：Ａ

．

碱性纤维素酶是一种可以在碱性条件下发挥催化作用的届一１，４．葡聚糖内切酶，广泛应用于洗涤剂、脱墨等行业¨４ｊ．洗涤剂中加入酶制剂，一方面可去除棉纤维上的污垢，另一方面还能起到使棉织物颜色鲜明和柔软的效果．与酸性纤维素酶不同，碱性纤维素酶是一种缺少葡聚糖外切酶和葡萄糖苷酶的非全组分的内切葡聚糖酶，不能发生酶组分间的协同效应．届．１，４一葡聚糖内切酶主要对棉纤维中占１０％左右的非结晶区（无定形区）的纤维素分子起作用，对结晶区纤维素水解活力很低，所以并不会明显降低棉纤维的牢固度．从自然界中筛选高活力口－１，４一葡聚糖内切酶产生菌，克隆其基因并利用强启动子进行表达是提高酶产量的重要措施．目前，虽然已有一些届－１，４一葡聚糖内切酶基因被克隆并同时也得到了表达，但表达活力大部分较低．本研究应用ＰｃＲ技术从一株短小芽孢杆菌Ｈ９中克隆了编码口．１，４一葡聚糖内切酶的基因，并将该基因构建在大肠杆菌

中得到了良好的表达．

１材料与方法

１．１

材料

短小芽孢杆菌菌株Ｈ９分离于土壤中，大肠杆

菌表达载体ｐＥ他０ｂ购于Ｎｏｖａｇｅｎ公司．

ＬＢ培养基＂ｏ的组成为：１％蛋白胨，１％Ｎａｃｌ，０．５％酵母膏，ｐＨ＝７．Ｏ，将其于１２１℃灭菌２０ｍｉｎ后备用．

限制性内切酶、连接酶、呦酶、ｐＭＤｌ８Ｔ载体及

蛋白相对分子质量标准物购于ＴａＩ（ａＲａ公司；羧甲基纤维素（ｃＭＣ）购于ｓｉｇｌＩｌａ公司；ＤＮＡ梯度标记物购于耵ＡＮＧＥＮ公司；胶回收试剂盒购于ＱＩＡＧＥＮ公司；引物由ｓａｎｇｏｎ公司合成；其他试剂均为国产分析纯．

１．２

方法

ＤＮＡ的提取采用十二烷基磺酸钠一蛋白酶Ｋ一

１．２．１，短小芽孢杆菌ＤＮＡ的提取酚氯仿法扣１．

表达载体ｐＥ配０ｂ中，结果显示其在重组大肠杆菌

收稿日期：２００７—０９—２６

女基金项目：广东省工业科技攻关项目（２００５８１０４０１０５１）

作者简介：郭成栓（１９７７一），博士生，主要从事酶工程研究．Ｅ—ｍａｉｌ：ｇｃｓ２００２２２＠１６３．ｃｏｍ十通讯作者：崔堂兵，副教授．Ｅ＿ｍａｉｌ：ｆｅｔｂｃｕｉ＠ｓｃｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ

万方数据　

第１２期

郭成检等：筘－ｌ，４一翻聚糖内切酶基因的克隆及表达

１．２．２廖，１，４一葡聚糖内切酶基因的克隆及序列分析

以抽提的Ｈ９细菌ＤＮＡ作为ＰＣＲ扩增的模

板，上游孳｜物为５’ＧＣ零Ｇ疆誓焱Ｃ鞑霉ＧＣ３’，下游零｜物

为５’ＴＴＡｍＡｌＴｒｃＧＧＡＡＧ３７．ＰｃＲ反应体系（５０肚）

为：ｌｏ×弛９缓冲溶液５斗Ｌ，模板ＤＮＡｌ斗Ｌ，浓度力

ｌｏ转ｍｏ汐Ｌ的弓｜物各ｌ弘毛，１０降ｆｎ出毛蠢Ｎ蕈ｐ

ｌ秘毛，

８３．３５吣＇Ｌ／（ｓ Ｌ）（５Ｕ／止）砌’ＤＮＡ聚合酶ｏ．５此，

超纯水３５。５斗Ｌ，混匀．反应条件：９４℃预变性５

ｍｉｎ，

９４℃变性ｌｍ遮，５０℃退火ｌ黼涵，７２℃延僚２ｍｉｎ，进行３０个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ．将ＰＣＲ扩增得到的２ｋｂｐ条带胶网收，然后与ｐＭＤｌ８Ｔ载体连接，转纯大肠秆菌Ⅸ差５理，筛选鬻性克隆进行序硼测定．将重组Ｔ载体送上海生工生物技术有限公司进行测序，碱基序列的比对在美囡国立生物技术信息中

心（ＮＣ转１）网站的转Ｌ焱鼹软件上进行．

１．２．３酶分子三维模型的构建

ｐ一１，４一葡聚糖内切酶三维模型的构建在匿内瓦

生物医学研究所建立发震起来的分子模建服务系统

ＳｗＩｓｓ—Ｍｏｄｅｌ上进行，其采用一系列工作软件，从循

白质结构数据库中提取蛋白质查询序列的模拟结构

信息，蔫具有蛋白质楣似性的已知结构强白建立未知结构蛋白的分子模型，酶结构显示和分析在软件Ｄｅｅｐｖｉｅｗ（ＳＷＩＳＳ—Ｐｄｂｖｉｅｗｅｒ

Ｖｅｒｓｉｏｎ

３．７）上进行．

１．２．４静ＮＡ的酶切、回收、连接及质粒的抽提

ＤＮＡ的酶切及连接参照ＴａＫａＲａ的说明书进行，ＤＮＡ回收按ＱｌＡＣＥＮ公司试剂盒进行，质粒的擒提参照文献［６］进行．

１．２．５

大肠杆菌表达载体的构建

以重组ｐＭＤｌ８Ｔ一％殛载体作为模板，重薪设计

一对弓｜物５’ＡＫＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＣＡＴｒＩ，ｒ瞄’，

５７ＡＴｃＧ

ＣＴｃＧＡＧｗＡＴＩｖｒＡＴＴｃＧＧＡＡＧ３’，分别弓１人

＆ｍＨｌ和觋ｏｌ酶切位点．进行ＰｃＲ扩增，反应条件同上，将扩增得到的２ｋｂｐ条带用内切酶＆ｍＨＩ和姗ｏＩ双酶切，载体ｐＥ他ｏｂ同样用眈ｍＨＩ和鼢ｏＩ

双酶切，鼹收大的片段，然后用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接两个大的片段，转化大肠杆菌菌株Ｂ弛ｌ（ＤＥ３），利

用ＬＢ氨苄青霉素平板筛选重组转化子，提取重组

质粒并翔内切酶酶切鉴定．１．２．６大肠杆菌的转化

大肠杆菌感受态的制备及转化参考文献［６］进行．

１。２。７

异丙基移移．硫代半乳糖蔷诱导勰牲转化子

分泌表达

挑取平板上的阳性转化子，将阳性转化子转到用

募丙基蛰一努一硫代半乳糖营（１鞭Ｇ）诱导且添懿Ｏ。２％’

羧甲基纤维素（ｃＭＣ）的ＬＢ培养基平板上培养一定

万　

方数据的时间，用０．２％的刚果红溶液染色２０ｍｉｎ，然后用

１

ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ溶液洗涤２０ｍｉｎ，观察水解圈的大小．

１．２．８辛二烷基硫酸钠一聚巍篱酰胺凝胶电泳检测

将重组大肠杆菌转化子接入含氨苄青霉素的

ＬＢ培养基中于３７℃培养过夜．以２％（体积分数）

的攘种量转蓟含氨苄青霉素的潍培养基中，继续

培养至对数生长期，加入异丙基够。Ｄ．硫代半乳糖苷直到终浓度为ｌｍｍｏｙＬ，诱导培养一定时间．取上述培养菌液ｌｍ乳于室温下１２∞０∥ｍｉｎ离心ｌｍｉｎ收

集菌体，加入１００汕２×十二烷基硫酸钠（ｓＤＳ）上样

缓冲液，予沸水中处理５诚ｎ，离心取上清进行一ｐ二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ—Ｐ轰ｃＥ）．１．２．９酶活及稳定性试验

酶活及稳定性试验参照文献［７］进行，

２结果与讨论

２。ｌ

酶基落的克隆及序烈分耩

应用ＰＣＲ方法克隆了编码８，ｌ，４一葡聚糖内切

酶的读码框基因序列，电泳显示该条带大小为２珐ｐ，与墨标条带大小撩同，将该窿列克隆到零载体ｐＭＤｌ８Ｔ中，送上海生工生物工程技术有限公司测序．测序结果表明，该基因读码框碱基长度为１９嬲ｂｐ，编码６５９个氨基酸．该基因序磺已被牧录于ＧｅｎＢａｎｋ，登录号为ＥＦ５０１９７５．该基因序列与ＧｅｎＢａｎｋ等国际核酸序列数据库的比对结果表明，其与枯草芽孢杆菌ＫＳ麓＿５２２强。及短小芽孢括菌

ｓ．２７∞１编码的葡聚糖内切酶编码基因具有较高的同

源性，达到９８％，其中与短小芽孢杆菌ｓ一２７的编码基因有３０个碱基的差剃，由于密码子蓠并性的存在，反映到葡聚糖内切酶氨基酸顺序上，则有８个氨基酸的差别．

露一ｌ，４一葡聚糖内切酶的结构域分析显示（见图

１），酶由两个不连续结构域组成：其一为Ｎ。端催化

结构域，由糖基水解酶家族９组成，该结构域主要起催他底物永解的作用，其中钧５—４２ｌ号氨基酸和４５５—４７３号氨基酸分别为酶的两个催化活性中心；

其二为ｃ．端底物结合结梅域，由碳水化合物绑定结构域家族３组成，从５０ｌ号氨基酸残基开始到６５８

号氨基酸残基拭１５８个氨基酸残撼，可以与纤维素表露结合ｐｊ，从而使催化易于进行。薅个催他结构域之间出一段连接肽连接．酶的Ｎ一端和ｃ一端结构不同，其中Ｎ－端催化结构域主要由仪螺旋结构组成，藤ｃ一端结合结构域主要纛§折叠结构组成。该类结构的纤维素酶报道较少，仅在芽孢杆菌ＫＳＭ巧２２及

１１４

华南理工大学学报（自然科学版）第３６卷

短小芽孢杆菌中有所发现‘９。１０１．该酶发挥催化作用的最适ｐＨ为碱性且作用的ｐＨ范围较广泛，是一种具有较强应用前景的洗涤剂用酶．

苄青霉素的发酵培养基中，当菌体生长到对数期后，加入诱导物ＩＰｒｌｌＧ、离心收集菌体，破壁，进行ｓＤｓ－ＰＡＧＥ分析，分别和空白菌株及未加诱导物的的转化菌株进行对比．由图３可以看出，在培养基中加入

１

ｍｍｏＬ／Ｌ的Ｉ阴Ｇ作为诱导物的转化菌株在相对分

子质量７３０００左右处有一表达蛋白条带，而未诱导

菌株及空白菌株则都没有条带，表达蛋白的分子大

小与理论值大小基本一致．

图１口一１，４一葡聚糖内切酶三维结构预测

Ｆｉｇ．１

３一Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ

ｓｔｍｃｔｕｒｅ

ｐｒｅｄｉｃｔｅｄｆｏｒ届一１，４一ｅｎｄｏｇｌｕ

２．２

表达载体的构建

两种引物分别引入了ＢｏｍＨ

Ｉ和翮ｏＩ位点．以

重组ｐＭＤｌ８Ｔ．魄ｚＡ为模板，ＰＣＲ扩增获得卢一１，４一葡

聚糖内切酶基因片段，长１９８０ｂｐ，将该基因克隆到

ｐＥ他Ｏｂ中，获得重组表达载体ｐＥ睨０ｂ一咏ｆＡ．利用

双酶切进行验证，结果证明质粒构建成功．

２．３

阳性转化子在ＬＢ平板上的分泌表达

按照１．２．７的实验方法，届．１，４．葡聚糖内切酶

在ＬＢ．ＣＭＣ平板上的分泌表达结果如图２所示．从图２可以看出，菌落周围具有较大直径的清晰的透明圈，这初步说明葡聚糖内切酶基因在大肠杆菌中得到了高效分泌表达．

图２口一ｌ，４一葡聚糖内切酶在ＬＢ—ｃＭｃ平板上的分泌表达

Ｆｉｇ．２

Ｓｅｃｒｅｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ卢一１，４一ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ

ｏｎ

ｔｈｅＬＢ—

ＣＭＣｐｌａｔｅ

２．４

重组葡聚糖内切酶的诱导表达及分析

鉴定

将重组质粒ｐＥ他ｏｂ一必ｆＡ转化至大肠杆菌菌株

ＢＬ２１（ＤＥ３）中，获得含有重组质粒的大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）重组菌株．将重组菌株转接到含１０ｍｇ／Ｌ氨

万　

方数据图３发酵产物的ｓＤｓ—ＰＡＧＥ电泳分析

ＳＤＳ—ＰＡＧＥｅｌｅｃｔｍｐｈｏｒｅｔｉｃａＪｌａｌｙｓｉｓｏｆｆｅｒｎｌｅｎｔａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓ

１一添加诱导剂Ｉ丌Ｇ的大肠杆菌Ｂ１２１（ＤＥ３）发酵液；２一未添

重组葡聚糖内切酶的酶活及稳定性

温度对重组葡聚糖内切酶酶活及稳定性的影响

在不同温度条件下测定重组葡聚糖内切酶酶

的比值（相对酶活）作纵坐标，温度作横坐标，所得蝗龆‘拓罂

图４温度对酶活及稳定性的影响

Ｆｉｇ．４

Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ

ｏｎ

ｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄ

ｓｔａｂｉｌｉｔｙ

Ｆｉｇ．３

加诱导剂ＩＰＩ＇Ｇ的重组大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥ，１２０ｂ一尉Ａ发酵液；

３～添加诱导剂Ｉ门Ｇ的重组大肠杆菌ＢＬ２ｌ（ＤＥ３）／ｐＥ，１２０ｂ一坛ｆＡ发酵液；Ｍ一蛋白相对分子质量标准物２．５

２．５．１

活，以不同温度下的酶活与最适温度（５５℃）下酶活

结果见图４．结果表明，重组葡聚糖内切酶酶活随温

第１２期

郭成栓等：届一１，４一葡聚糖内切酶基因的克隆及表达

１１５

度升高而升高，温度达到５５℃时，酶反应速度最快，温度继续升高，反应速度反而下降．将重组葡聚糖内切酶分别在３０℃至７０℃的条件下保温一定时间，检测剩余的酶活，以不同温度下的残余酶活与最稳定

温度（３０℃）下残余酶活的比值（相对残余酶活）作

纵坐标，温度作横坐标，所得结果见图４．结果表明，重组葡聚糖内切酶在５５℃以下时具有较好的稳定性，随着温度的升高酶的稳定性下降，酶在不同温度下的活力与稳定性与原始菌株Ｈ９的比较接近．

２．５．２

ｐＨ值对重组葡聚糖内切酶酶活及稳定性的

影响

在不同ｐＨ条件下分析重组葡聚糖内切酶的活力，以不同ｐＨ值下的酶活与最适ｐＨ值（ｐＨ＝８）下酶活的比值（相对酶活）作纵坐标，温度作横坐标，所得结果见图５．结果表明，该酶最适ｐＨ值在８左

右，在７～９之间都具有较高的酶活．将重组葡聚糖

内切酶在不同ｐＨ值的缓冲液于４℃保温１ｈ，检测

剩余的酶活，以不同ｐＨ值下的残余酶活与最稳定

ｐＨ值（ｐＨ＝７）下残余酶活的比值（相对残余酶活）作纵坐标，温度作横坐标，所得结果见图５．结果发现，该酶在ｐＨ＝５～９时具有较好的稳定性；而在ｐＨ值小于４或大于１０的条件下酶活丧失较快，与原始菌株Ｈ９产生的葡聚糖内切酶基本一致．酶在不同ｐＨ值下的活力与稳定性与原始菌株Ｈ９比较接近．

！ｌｇ

溢款晕

图５

ｐＨ对酶活及稳定性的影响

Ｆｉｇ．５

ＥｆｋｃｔｓｏｆｐＨｏｎ

ｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄ

ｓｔａｂｉｌｉｔｙ

３

结论

应用ＰｃＲ方法克隆了短小芽孢杆菌Ｊ８—１，４－葡

聚糖内切酶基因．基因序列分析表明，该基因读码框为１９８０ｂｐ，编码６５９个氨基酸．对酶的三维结构研究结果表明，该类酶有两个功能区域，一是Ｎ．端由糖基水解酶家族９序列组成的区域，起催化作用，二

万　

方数据是ｃ一端的结合区域，由碳水化合物绑定结构域家族３组成，从５０１号氨基酸残基开始到６５８号氨基酸残基共１５８个氨基酸残基，可以与纤维素表面结合，两个结构域之问由一段连接肽进行连接．

将卢一１，４．葡聚糖内切酶基因构建在大肠杆菌表达载体ｐＥ他ｏｂ中，得到重组表达载体ｐＥｒｌｌ２０ｂ一

魄ｆＡ，将重组载体转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），获得

Ｂ１２１（ＤＥ３）重组菌株．在诱导物ＩＰｌ’Ｇ的诱导下，口一１，４．葡聚糖内切酶基因在大肠杆菌中实现了高效分泌表达，为该酶的后续定向进化研究及应用奠定了，良好基础．参考文献：

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（下转第１４５页）

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ＥｘｉｓｔｅｎｃｅｏｆＳｏｌｕｔｉｏｎｓｔｏ

Ｅｑｕａｔｉｏｎｗｉｔｈ

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Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ａｎｅｗＳｏｂｏｌｅｖｓｐａｃｅｉｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｎｄｅｉｇｅｎｖａｌｕｅｐＩＤｂｌｅｍｏｆｔｈｅＰａｓｓＬｅｍｍａ

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（上接第１１５页）

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万方数据　

β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及表达

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：

郭成栓， 崔堂兵， 郭勇， Guo Cheng-shuan， Cui Tang-bing， Guo Yong华南理工大学,生物科学与工程学院,广东广州,510006

华南理工大学学报（自然科学版）

JOURNAL OF SOUTH CHINA UNIVERSITY OF TECHNOLOGY(NATURAL SCIENCE EDITION)2008,36(12)2次

参考文献(10条)

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引证文献(2条)

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