荧光定量PCR的原理及其应用

荧光定量PCR的原理及其应用

蒋昌龙

荧光定量PCROutline 荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR应用

PCR 反应过程3’ 5’ 5’ 3’

Primers

d.NTPs

Taq 酶

反应组分

变

性

3’

5’

5’

3’

退

火

3’

TaqTaq3’

5’

延 重

伸 复

3’

3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’

5’

循环2 4个拷贝3’

3’

3’ 3’ 3’

3’ 5’ 3’ 5’ 3’

5’

循环3

3’

5’ 3’5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 3’

3’ 3’

8个拷贝

3’

PCR反应模式TheoreticalLog Target DNA

Real Life

Cycle #

同一样品96复孔的实验结果

荧光定量PCR

原理

常规PCR 电泳鉴定

缺憾 无法对初始模板精确定量 无法实时监测扩增情况 跑胶繁琐、易污染

荧光定量PCR

原理荧光定量PCR 在体系中引入荧光染料 实时检测 扩增阶段： 指数期 平台期

荧光定量PCRC(t) value Threshold line

原理

阈值：荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准 C(t)值：荧光信号到达阈值时所经过的扩增循环次数

荧光定量PCRX=X0(1+Ex)n

原理n:扩增反应的循环次数 X:第n次循环后的产物量 X0:初始模板量 Ex:扩增效率

log X=log X0 (1+Ex)n

log X0= (- log(1+Ex) )*n+ log X

log X0= (- log(1+Ex) )*C(t) + log Xc(t)

初始模板的Log10值与Ct值呈线性关系！

荧光定量PCR设定标准品，绘制标准曲线

原理

106

105104 103 102 10

荧光强度---循环数 曲线

初始模板量对数---C(T)循环数标 准曲线

荧光定量PCR

原理

通过标准曲线对未知样品模板进行准确定量

unknown Ct值

104103

荧光定量PCR两种定量方法 绝对定量标准曲线法

原理

相对定量双标准曲线法 2 -ΔΔc(t) 法

荧光定量PCR绝对定量

原理

通过浓度梯度标准品，绘制标准曲线 样品结果与标准曲线比对得到精确的浓度 精确定量 大范围拷贝数样品同时检测 –100 — 1010 省时有效 临床检测，转基因检测，环境监测等

荧光定量PCR相对定量

原理

设置内标：b-actin、GAPDH等管家基因 对靶基因进行均一化：靶基因拷贝/每一个内标 基因拷贝 双标准曲线法 含靶基因与含内标基因的浓度梯度质粒分别做标准曲线； 样本靶基因与内标基因绝对浓度的换算，并均一化处理； 标本间靶基因的表达水平分析 2 -ΔΔc(t) 法

标本内靶基因与内标基因Ct值比较：ΔC(t) =C(t)m - C(t)n标本间ΔC(t) 比较： ΔΔc(t)= ΔC(t)1 - ΔC(t) 2 2 -ΔΔc(t) 计算