分类学

放线菌的分子分类

专业：农学系生物技术

班级：07级（1）班

姓名：洪凤美

学号：0701024102

分类学

放线菌的分子分类

摘 要 在放线菌分类学研究中,最初是根据形态特征、生理生化特征等表观分类学特征进行研究。随着分子生物学的飞速发展,放线菌的分类鉴定亦从传统的表型分类进入到各种基因型分类水平。分子分类在放线菌分类研究中起到越来越重要的作用,目前放线菌的分子分类研究主要包括: G + Cmol %测定、DNA杂交、核酸结构分析以及DNA指纹图谱分析等方面。

关键词 放线菌,分子生物学,分子分类

从1875年Cohn发现放线菌至今已有100多年的历史,放线菌分类学作为微生物分类学的分支学科得到了长足的发展,经历了经典分类,化学分类,分子分类和多相分类4个时期。随着科学技术的快速发展,尤其是分子生物学、细胞化学、分子遗传学以及生物信息学的发展,放线菌分类研究也从传统的表观型跨越到了分子水平。1981年Stackebrandt等根据16S rRNA基因相似性,核酸杂交的结果,描绘了放线菌和其他生物之间的系统发育树,用分子生物学手段对传统放线菌分类体系进行了补充和发展,标志着放线菌分类学分子分类(Molecular taxonomy)时期的开始。而随着分子生物学和遗传学研究的深入开展,分子分类在放线菌分类学研究中起到越来越重要的作用。本文就目前放线菌分子分类中常用的方法及其优缺点等进行简述。 1 DNA碱基组成分析

DNA碱基组成比例(G + C mol% )是典型的基因指征之一,一般认为G + Cmol %在种内不超过3% ,在属内不超过10% ,相差低于2%时没有分类学意义。放线菌属于高GC含量的生物,放线菌的G +Cmol %变化最多不超过30%。G + Cmol %分析已成为放线菌鉴定的基本方法,作为描述放线菌分类单位的特征之一。但值得注意的是G +Cmol%含量的分析主要用于分析不确定的分类单元,而不是用它去建立一个新的分类单元。 2 基于核酸杂交的分析

2. 1 DNA-DNA同源性分析

DNA-DNA 同源性常用于亲缘关系密切的微生物种内相似性描述。它在检测错分菌株以及新描述的菌株划归已有分类单元时非常有用。DNA的杂交值可反映出两基因组间序列的相似性;已经证明,每错配1% ,杂交热稳定性降低1% ～2. 2%。1987 年,国际系统细菌学委员会规定,DNA同源性≥70%或杂交分子的热解链温度差≤5 ℃为细菌种的界限。在放线菌分类中,DNA-DNA分子杂交已被确定为建立新种的必要依据之一。目前DNA-DNA分子杂交的方法主要有固相膜杂交、液相复性速率法等。

2. 2 DNA-rRNA 同源性分析

在进化中, rRNA 分子的功能几乎保持恒定,而且其分子排列顺序在有些部位变化非常缓慢,保留了祖先的一些序列,即其序列比DNA更保守。因此DNA同源程度很低的2种微生物在DNA-rRNA杂交中有时会表现出很高的同源性。这使得rRNA在分类研究和系统发育上具有DNA-DNA杂交所不可比拟的优越性。一般来说DNA-DNA杂交反映种及亚种水平的信息, 而DNA-rRNA杂交反映的是属与属以上水平的信息。 3 基于核酸结构的分析

3. 1 核酸一级结构的分析

3. 1. 1 16S rRNA / rDNA基因序列的分析

在漫长的进化中, rRNA的结构有较好的保守性,因此一些特征核酸序列,成为了属种鉴定的分子基础。其中位于原核细胞核糖体小亚基上的16S rRNA长约1 540 bp,结构和碱基排列复杂度适中,较易于进行序列测定和分析比较,因此广泛被用作细菌之间种属鉴定的依据。该技术目前在放线菌分类中常被用于放线菌种属的初步鉴定,但是值得注意的是仅根据该指标并不能确定菌株的种属,必须结合其他的分类指标。

3. 1. 2 16S～23S rRNA 转录间区序列的分析

16S～23S rRNA 转录间区序列( 16S～23S rRNAIntergenic Spacer Regions, ISR)的进化速率比16SrRNA大10 倍,在细菌的不同属种中拷贝数、碱基排列顺序以及内含的tRNA基因的数量和种类均不同,其序列大小比16S rRNA 更具直接测序优势,通过PCR后电泳显示ISR多样性和序列分析可鉴别细菌属与种。但是16S～23S rRNA的不同拷贝之间大小比较相近且不易区分,需要采取有效的手段,以确保能够扩增出所有的拷贝。

3. 2 RNA二级结构的分析

1981年,Woese等以E. coli的16S rRNA基因为研究对象,初步推断出了16S rRNA 基因二级结构模型,揭示其具有比一级结构更大的保守性,并且具有很多一级结构没有的特征,如茎环结构等,这些特征有很强的种属

分类学

特异性。近年来RNA二级结构的研究逐渐为分类学家所关注,已有分类学家利用16S rRNA的二级结构进行种属,甚至更高分类级别的修正和分析 。但是由于RNA二级结构模型仍不是十分完善,该项指征在放线菌分类学领域还没有得到普遍推广,相信随着相关研究的不断深入, RNA二级结构会作为一个新的分类指标,成为系统分类的一个重要补充。

4 基于DNA指纹图谱的分析

4. 1 PCR2RFLP分析

DNA限制性片段长度多态性分析(Restric-tion Fragment Length Polymorphism, RFLP) 是上世纪末兴起的一种DNA分析技术。人们将PCR技术与RFLP分析结合,即利用PCR技术扩增普遍存在于菌株中的保守基因区域,再用特异的限制性内切酶对得到的基因片段进行酶切、电泳和图谱分析。

目前16S rDNA PCR-RFLP已是细菌分类中应用最广的快速分群方法,张海涛等曾应用该法有效地对海绵中放线菌进行了种属分群。该法的结果与16S rDNA 序列分析具有很好的一致性,且避免了序列测定等步骤,在普通实验室即可进行。其缺点是DNA酶切片段组分往往较复杂,难以比较遗传学关系较近的菌株。

4. 2 rep-PCR指纹分析技术

重复片段PCR基因指纹分析(Repetitive-ele-ment PCR genomic fingerp rinting, rep-PCR ) 是基于重复DNA片段的分型方法。在细菌染色体上存在着一些多拷贝、高保守的重复DNA 序列,rep-PCR指纹分析技术使用互补于这些重复序列的引物,使位于重复序列间的不同基因区域得到选择性扩增,对PCR产物进行电泳图谱分析,即可实现种及以下水平的分类和快速鉴定。Rep-PCR方法简单、快速、灵敏,因此它在遗传多样性研究及鉴定同源性很近的菌株时是一个有效的方法。该技术已用于放线菌有关属的分析并获得了较好结果。

4. 3 RAPD分析

随机扩增的多型性DNA分析(RandomlyAm-plified Polymorphic DNA Analysis, RAPD) ,是用单个随机寡核苷酸序列引物对DNA进行扩增,并对扩增产物长度的多态性进行分析的方法。

RAPD分析的优点是不需要基因组的任何信息,可直接由RAPD所提供的基因组DNA指纹图谱对菌株进行分析。利用该方法可以简单快速地对菌株进行聚类分析,但是反应条件需进行严格控制,以确保结果的可比性。

4. 4 AFLP指纹分析技术

扩增性片段长度多型性分析(Amp lifide Frag-ment length Polymorphism, AFLP) 技术是近年来兴起的一种检测DNA多态性的方法。该技术采用一对限制性内切酶消化DNA,产生一系列DNA限制性内切酶片段,以此为模板,利用选择性引物扩增,得到AFLP指纹图谱。该方法的适用范围与RFLP、rep-PCR 、RAPD和细菌可溶性蛋白质谱相似,且AFLP 综合以上各方法的优点,分辨率仅低于全基因组序列分析,稳定性强,可提供更为丰富的分类信息,非常适合指纹图谱的绘制、遗传连锁图的构建及遗传多样性的研究。但是由于AFLP操作繁琐,加之其检测基于基因组上酶切位点的变化,制约了其在相关领域的应用。

4. 5 其他的DNA指纹图谱技术

其他的DNA指纹图谱技术如基于变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE) 、温度梯度凝胶电泳( Temperature gradientgel electrophoresis, TGGE) 的DNA 指纹图谱等。这些技术均具有分辨率高,鉴定迅速,重复性好等特点,并且可对等长的PCR产物进行进一步的分离,提高了鉴定的准确性,因此在国外已被应用于微生物分类学研究,但是由于其对DNA片段的长度和电泳条件等有较高的要求,目前在国内并没有得到广泛的推广和应用。

经过长期的发展,放线菌分类学的研究已经从表观现象到基因本质逐步深入,分子分类作为放线菌分类学的一个新兴的分支,正展现出蓬勃生机。目前,一些已经完善的分子分类方法,如核酸序列测定,核酸杂交等已成为放线菌分类研究的基本方法,相信随着理论研究的不断深入,凝胶电泳技术等相关技术的不断发展,各种分析测试仪器的不断普及,更多的分子分类方法,如RNA二级结构测定等将在分类学领域发挥更大的作用。这些新兴的方法与传统的分类方法相结合,互相交叉,彼此补充,必将促进放线菌分类学的不断发展,使放线菌分类体系日臻完善。

分类学

参考文献

[1]陈国忠, 姜怡, 唐蜀昆,等. 16S rRNA二级结构可变区图形分析在放线菌分类中的应用[ J ]. 微生物学通报, 2006,33 (2) : 1842187.

[2]张海涛, 靳艳, 虞星炬. 16S rDNA2RFLP 分析繁茂膜海绵可培养放线菌的多样性[ J ]. 微生物学报, 2005, 45( 6):8282831.

[3]张建丽, 刘志恒. 链霉菌的rep2PCR基因指纹分析[ J ]. 微生物学报, 2004, 44 (3) : 2812285.

[4]王世伟, 齐小辉, 刘军,等. AFLP技术在微生物分类鉴定、基因标定及遗传多样性方面的应用[ J ]. 生物技术, 2003,13 (5) : 42243.

[5]冯佩英. DGGE / TGGE技术在微生物基因分类鉴定中的应用[ J ]. 国外医学临床生物化学与检验学分册, 2005,26(2) : 95297.