湖北稻疽病菌生理小种和水稻抗疽性的鉴定及生化机制研究

缩略语表

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Pl i l n loe o v y yodn y np iNi u tt z l m t b e r oi o r l ea u

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Ri o a i b f vn l Me t Bo ie r m b mi vn S u Al u n e

核黄素甲硫氮酸牛血清蛋白过氧化物酶

Pey l i a m n -a hnla n m oil s a n e ay e

苯丙氨酸解氨酶超氧化物岐化酶

Spr i d m te ue x e u s od i a s

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湖北稻疽病菌生理小种和水稻抗疽性的鉴定及生化机制研究

摘

要

稻瘟病是由 半知菌亚门稻梨 yc aa e Coe a .真菌抱Pru r gs (ok) c【 ili r a i S c有性世代为赫 n ohgs (e r Br引咭 a rere Hb t a 1起的世界 p t ia e) r性水稻病害，我国为水稻“三大病害”之一。目前该病的防治采取以种植抗病品种为主的综合治理措施。但病原菌的致病变异性和遗传多样性常导致水稻新品种丧失抗性，因此研究稻瘟病菌的致病性分化，对于抗病品种的选育和病害流行的预测极为重要。长期的实践表明，选

育、种植抗稻瘟病品种是最经济有效的防病措施.研究、分析抗瘟性的生化机制，对于水稻抗瘟性的高效持久利用、新化学防治药物的开发、抗病基因的克隆和抗病

品种的选育具有理论和实际指导意义。本文研究内容包括三个方面：湖北主要稻区稻瘟菌生理小种鉴定；不同水稻品 种人工接种对稻瘟病的抗感性评价；水稻品种抗感稻瘟病的生理生化机制研究。结

果表明，从湖北省 1个县 ( 6市)1个水稻品种上分离获得的5个稻瘟病菌株，可 5 6

划分为6 8群2个生理小种，大多为釉型小种群，其中Z优势种群， A为优势 A为 Z,生理小种。且不同地区和品种上生理小种的分布差异较为明显。根据对湖北等地收集到的9个主要水稻品种进行稻瘟病的人工接种鉴定， 1抗感性鉴定结果显示，参鉴的9份水稻品种， 1抗病或中抗品种所占比例不足 2%, 5仅有

2% .的品种表现为抗， 2其余均为感病或中感品种。筛选鉴定过的抗感稻瘟病的水稻品种， 对抗感性差异显著的品种作生理生化机制研究。研究对筛选出的4种从参鉴的9份品种中，个品 1选取有代表性4个抗感病品种，进行防御酶活性和可溶性蛋白含量测定，结果表明过氧化物酶 (O )苯丙 PD、氨酸解氨酶 ( L,超氧化物歧化酶 (O ) P ) A SD 3个防御酶活性变化与水稻的抗感性有一定的相关性。 O P D活性与抗瘟性呈正相关。抗病品种酶活性在接种后 2 4小时分别达到了60 0多和 90 0多个酶活单位，而感病品种两优培九基本与对照持平，有20 0多个酶活单位。接种后的%小时内， O酶活性呈上升趋势， PD且抗病品种 9小 6时酶活性是 2小时的2感病品种只有 15抗病品种较感病品种 PD 4倍， .倍， O酶活性增幅更大。PD O酶活性程病程初

期P D同工酶活性增强，有利于水稻对稻瘟病的抗 O

性。S D活性的早期变化与抗瘟性呈负相关，SD O O酶活性总体趋势是抗性品种持续下降， 4 2小时酶活性是9小时的2 P L活性高低是水稻抗稻瘟病的重要机制， 6倍. A PL A活性高低以及峰值到达的时间早晚与抗瘟性有密切联系， A活性高、峰值到 PL来得早有利于抗瘟性的发挥。可溶性蛋白与水稻抗瘟性呈正相关。可溶性蛋白质含

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量上升速度快、上升时间早、幅度大，有利于抗瘟性的表达.关键词：稻瘟病；生理小种；生化机制：防御酶：同工酶

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Ab ta t sr c

Rc b sManpt g e Hbr Brt nm r i ycli re ( ga re s ( e) rh aa o h Pru r gs i lt e a oh r a e t a(e p s i aa a i i (ok) c ioe h m siprnre a t t e ocr d l i C oeSc. s o t ot oa i d e e wdl c r ia re a ) n f e m t t i s h i y u n c c s a e lbl it w r . p s th cnoot d estt e tg snvrts es h od A r e, ot l e a o p nn r iat ee t n e l t n t e e r f i e a l i e t a i h s k a s i

m iy n g t m ngm nm a r . t pt gn i a nt vrbi a lo iere aae et s e B t a oeit rg ec i i n f a d t e u s u h h cy e i aa l e e y t ad e i e ld tt l s e re ii r iat h s d pt t e n d rto n s h o o nw vrts sn Te y h y s i s f e o s f i aee e t, t a o p v y t a e c s us ul e nao, a - st t ee o b ei, f ea t pea ne e ad r ttnd es r ia vrts r d gad cs h r l c x i e ii i e sn a i f n n o t v e f s e i e r e

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(O )pey l i a m n -a ( L, e x e m t e D a it P D, nla n m oil s P )Spr i d u s (O ) v o h an e ay e A u od i a S s ci f ty t e df s e nead r iac ore rie ooareac. ia h e e i cags t e sne i a a m tnl vneP D r e nv h n h st e f c tn i e c e l O s re s r iac oe t iprn m cai s ad a it d e e i b t sne o h m oat hn m, i cv a d a c l et a s n f e t e s n t ti n is s y s r iac a psi lcrle. i zm cu e y v ao dc e esne i e o a dP D y e r e la iti l cnui st e r ot y r t O s v e o o s a c i s o v r ty s tre t t c. a itit er cagsre t t c oe h o b sr ia eS D v h ay ne i b sr ia e o t i l esn O c i n l h, l e sn n f c a s ty e c a s e iprn m cai sb sr iac ad a it gte crle. m oat hn m, t sne i cv w n avl o a d P L t e s l et a s n t ti a e i y r t A s y s e a it eo re t sne n oat hn m P L

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湖北稻瘟病菌生理小种和水稻抗疽性的鉴定及生化机制研究

第一章文献综述稻瘟病是水稻的三大病害之一，又称稻热病、叩头瘟等。从秧苗至抽穗后期都 会发病。根据水稻植株受害时期和部位的不同可分为：苗瘟、叶瘟、节瘟、叶枕瘟、穗颈瘟和谷粒瘟。广泛分布于水稻栽培的国家和地区，每年都造成严重损失，流行年份，重病地区一般减产 1%2%, 0 0重的达4% 50, 0 -/局部田 0a块甚至颗粒无收。 0 9

年来，稻代以我国瘟病的年发生面积均 8万h '上，在30 m以年损失达数亿公稻谷斤。由半知菌亚门 真菌稻梨抱P ili r a o e S c有世为Mga re ycaa i Co ) .性代 a p t rurgs ( k a【 e c n oh gs Hbt Br5 r a e r a]l i ( e) t起的稻瘟病在世界各稻区均有发生， e在适宜发病条件下为害严重。据估计，在 17-19年的 1年间因稻瘟病的发生造成全球水稻产量损失 95 90 6

高达 1 7 t .亿，年平均超过 1 0 t 5 0万。多年的

实践证明， 0采用化学防治和栽培抗病品种能有效地控制该病的严重发生。但化学防治既污染环境又昂贵，抗病新品种常在栽培 3年后被新的优势致病小种 (侵袭而沦为感病品种。 -5群)故培育抗病品种一直是防治稻瘟病的最有效、经济途径。由于抗稻瘟病育种的成效是建立在人们对稻瘟病菌、品种对抗稻瘟性及遗传的认识之土的，故多年来人们对其进行了广泛的研究。

1水稻稻瘟病菌的特性11 .菌株来源的多样性稻瘟菌 ( g p t gs寄主范围 a a re e) M n oh r a i很广，自件下可寄然条生于1科6属 5 6 1种禾本科 1 8植物和杂草上。从其它寄分离的M幼s能但主上 . e侵染水 a稻的究竟有多少尚不清楚。沈瑛等人从 19年起， 92在稻田内外的禾本科寄主和杂草上采集并分

离了 1个非水稻分离菌株， 0 8用人工接种、模拟自然发病条件的方法进行交互接种发现： 2个来自湖南烟溪病圃的马唐瘟菌株具有稻瘟菌的指纹图谱， 1而个来自四川蒲江病区的稻瘟菌菌株却具有草瘟菌的指纹图谱，其结果与近期菲律宾、哥伦比亚、孟加拉、南印度、巴西等国的学者报道的结果基本一致，证实了某些稻瘟菌偶

尔可侵染杂草。而有些非水稻分离菌，如从牛筋草、狗尾草、李氏禾、稗、马唐、罗氏草、龙爪樱等分离得到的瘟菌亦可侵染水稻，它们在自然界适宜的气候和人工接种条件下均可彼此互交侵染。

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12 .生理小种的多样性稻瘟病病原菌(yc aa a是半知梨抱属，有性阶段为( a a re Prur gs ) ili r i e菌其 Mg p t n ohgs ) re属子囊菌。寄主范围 ia很广，可侵染 4 0多种禾本科植物和其它寄主，并且存在致病分化变异性。稻瘟病的生理小种很多， 12年日早在 92本育种学家佐佐木发现，抗菌株 A的生理小种却感染菌株 B (何月秋，20 ) 01。在进入 5年代后，病菌的生 0理小种得到了广泛的研究。O (95 u 9 )曾报道在菲律宾田间采集的稻瘟病菌的生理 1

小种多达20 5个，而且不稳定，可以继续分化成大量新的生理小种。15年，日本 95设立了一个“稻瘟病菌小种协作研究项目”至 7年代，本选出了 1个鉴别品种， 0日 2 ( 个、中国4热带2个、日 6。在 7年代末期和 8年代初期，曾组织了本个)我国 0 0许多省跨地区联合攻关，筛选出有特特普、珍龙 1、四

丰 1、东农 33 3 3 6、关东5, 1合江 1和丽江新团黑谷等 7 8个品种组成的一套鉴别品种 (何月秋，20 ) 01。利用 7个中国统一鉴别品种对 19-99 9719年采集自苏省吴江，高邮等 5个代表地区的 35 2

个稻瘟病菌株进行小种鉴别。年共检测到2个生理小种， 3 1其中Z, G小种出现频率最高，达 5. 0-6.% ( 7 0o 7 9陆凡， 02。比 8/ 8 20)较一致的认为是各地区生理小种组成的差异主要受水稻栽培品种的影响，当一个地区的主栽品种相对稳定时，其稻瘟病菌优势小种组成亦相对稳定。但随着参试菌株的增多，各国发现的生理小种数也增

加 (anB1 1。日 Vlt 9)本根据F r e, 9 l的基因对基因学说， o对品种进行了抗病性分析，于 17年建立了一套具有己 96知抗病基因的9个粳型品种组成的鉴别品系。中国农科院作物所稻瘟病害研究室采用近等位基因系对稻瘟病菌的生理小种进行鉴别 (凌忠专， 00。 20 )但是，迄今为止，国际上还没有一套鉴别品种 (适合于世界各稻区系)的共同利用。

13 .生理小种的易变性关于稻瘟病菌的 变异能力，报道，曾菌株的生理小种是极不稳定的( u18。 O,95)单个病斑上分离的单抱菌株的致病性也不相同；田间稻瘟病菌株的组成也随季节、

年度而有变异。菌株继代培养过程中也可改变致病力 ( A DM, 90。不过， I N . 19) W也有人报道稻瘟病菌生理小种是相对稳定的.大部分生理小种继代培养了 1- 0 0年 2仍然保持了原有的产抱能力，生长特性以及致病力。 om n B n a等对 O等的研究过的 u稻瘟病菌株再进行鉴定，结果与原来的结论不一致。认为是由于接种病菌的环境条件不稳定影响菌株高度变异 (om n 97 L e等认为稻瘟病菌的生理小种 Bn a, 8) 1。而 ir te

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还是相对稳定的，关键在于控制稳定的鉴定条件。采用分子标记技术检测保存了3 0年的菌株，结果表明菌株是稳定的 (何月秋， 01。 20 )关于稻瘟病菌群体多样性和易于发生变异方面，所有稻瘟病专家认为是一致的。有人认为在众多的稻瘟病菌株中

存在少量稳定菌株，就其而言，其致病性在 2 - 3年内不会有明显变异。但随菌株保存时间的延长，其生活力和致病性均有下降和减弱的趋势。菌株致病性变异常常只

在少数几个鉴别品种上发生。而对多数鉴别品种的致病

性是稳定的(王久林，93) 19。关于变异机制， a i a H so等和 W利用电镜观察，证明绝大部分细胞为单核， hk u推断异核现象不是变异主要原因.何月秋 (0 1 20 )等认为产生小种或致病类型多样性的动力土要是菌株的自发突变，其次才是准性重组和有性重组，而多核现象是否存在还尚有争论。即使有，它也只是与菌丝融合现象一样，是准性重组的前提。而迁移是指一个具有强毒力突变株从突变的局部地区向广大地区扩散的必经途径。

2水稻对稻瘟病的抗性21 .抗性鉴定与评价水稻品种抗病性鉴定是抗病育种的重要环节，可靠的抗性鉴定技术是抗病育种

的重要保证。水稻抗病性一般选择在稻瘟病常发区建立病圃，采用一定数量的强致病力代表菌株，自然诱发或人工喷雾接种以及二者结合进行鉴定评价。然而潘汝谦等对这种传统的抗瘟鉴定方法提出异议，认为“代表性菌株”的代表性因同一小种不同菌株之间有不同的致病类型而存在局限性，提出将生物间遗传学的方法和传统的鉴别寄主法有机结合起来鉴定和评价水稻品种的抗瘟性，其联合抗病性系数和联

合毒性系数测定法也为通过品种的搭配利用防治稻瘟病提供了理论依据。在持久抗瘟品种筛选研究中，为了克服田间抗性指标筛选数据大而分散、无系 统性等缺点，肖放华等提出可以采用系统聚类分析法进行筛选，这种方法一方面能对水稻持久抗瘟性的评价在定量和定性上得到统一，系统而全面地反映水稻品种的

抗瘟能力，另一方面，又能在早期作出准确预测，减少工作量。此外在实际抗病育种工作中，这种直接鉴定选择因为需要创造特殊环境进行筛 选鉴定，不仅育种时间长，而且受到许多条件的限制。所以随着水稻抗瘟基因分子标记技术的发展，有人提出了分子标记辅助选择技术。分子标记辅助选择利用抗病基因和分子标记之间的紧密连锁，对抗病基因进行间接选择，这种方法不受其它效应和环境影响，可在早代进行选择，快速聚合多个抗病基因，培育持久抗病品种，

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是提高育种效率的有效途径。当然，在实际应用中要求辅助选择的分子标记与目标性状的重组率必须很低，所以这种方法是以抗病基因的精密标记为前提的。

至于植株的抗感评判在我国还没有共同的标准，各种标准都在一定程度上存在 着人为性.赵开军等认为关键要在同一研究中使用同一个标准去衡量每个植株，且

实验结果能从不同角度相互应证

,以便在一定程度上把握实验结果的可靠性。

22 .水稻抗瘟性遗传研究 221 ..研究历史与现状水稻抗瘟性遗传研究是抗瘟育种的基础工作，其目的在于揭示水稻抗性遗传规

律，并为抗病育种提供需要的抗源，而且在明确抗性基因及其等位性的基础上可以为抗病品种的合理利用 (品种轮换、品种搭配)和稻瘟病的预测预报提供科学依据，从而有效地控制稻瘟病的发生和流行。

培育 种的抗病品关键在于掌较抗源材’握好的料o从抗性的定基因位和克隆来说，7年代开始通过经典遗传学方法陆续从粳稻上鉴别出了 1个抗性基因，0 0 3 8年代后，

从釉型品种尤其是中国品种上也发现了一批抗性基因如 P h (, z, i -1 P- h P - t i ) i

-, 1 (, 1 (, i 1 (,地<等，今己定并名T 8 P 3 P 4 P 5 P i - t i ) - t - t i ) ) - t )迄鉴定3多个抗病基因，其中分子标记定位的基因有P-2 0 i ()等二十几个。抗瘟基因标 t

记的方法有群分法 (或近等基因池法)和近等基因系分析法。目前己经克隆出抗稻瘟病基因2 (i b P- )经注册的抗稻瘟病基因有2多个。个 P-, t,己 i 0不断地发现和利用抗稻瘟病基因是水稻育种科研人员长期挑战的对象和目标。

222 ..水稻抗瘟性的类型及特点水稻抗瘟性的类型因不同的分类依据而划分为很多种，其中垂直抗病性和水平

抗病性是最常见的分类法，这是依据水稻品种是否具有小种专化抗性而划分的。垂直抗性大多由 1一个、少数 3个主效基因控制，属质量抗性，田间抗感反应区别明显，所以易鉴定、选育和推广，但这种抗性不持久，容易因其毒性小种上升为优势

小种而丧失抗性；水平抗性则由多个微效基因共同控制，属数量抗性，田间只表现中等抗性，而且对多个菌株的抗性趋于同一水平，抗性不易因小种组成变化而丧失，抗性持久，但是这种品种较难鉴定、选育和推广。

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我国的 抗瘟遗传研究起步较晚， 0 2世纪6年代略有报道， 0 0 2世纪8年代才开 0始大量深入研究。从目前研究结果来看，抗瘟基因由 1 2对或 3对、对组成，由2对抗瘟基因控制的情况下，个别基因不完全显性，少数抗性由 1对隐性或 1对显性基因和 1对隐性基因共同控制：关于细胞质作用，有人认为不起作用，有人认为以核遗传为主，细胞质对

抗瘟性也有影响，这可能与研究材料有关。有关杂交稻亲本

的抗性遗传特性，王久林等将其归为完全显性、隐性、不完全显性、基因互补、全感和全抗 6种形式，但以完全显性遗传为主；王国平等研究也表明，亲本抗性对杂交种的遗传主要表现为显性类型。

223 ..抗性遗传分析方法抗性遗传分析必须通过抗感反应推断抗性基因，分析的方法有普通基因分析法 (杂交法)累积分布曲线法、、突然突变体法等，方法不同，使用范围不同，各有优缺点。杂交法是清泽早期介绍的抗性基因分析法，而后于 17年他又创立了累积分 94布曲线法。

普通基因分析法是水稻抗瘟遗传分析最常用的方法，其基本原理是利用抗感杂

交F推断抗病基因的显隐性，,抗感正反交推测抗性属于胞核还是胞质遗传，再利用F抗感分离比 2例推测控制抗病性的基因数目并用 BF进行验证，,,,还可以将待测抗病亲本之间杂交或分别与其他己知抗病基因的近等基因系材料杂交，获得F. l F世 2代，据抗感分离情况推出未知抗病基因之间及其与其它己知抗病基因之间的等位性关系。

累积分布曲线法克服了接种鉴定易受环境影响的缺点，适合分析抗性基因组成 比较复杂的品种，采用这种方法既可以推测抗病亲本的抗病基因数目验证F的结， 2

果，且比几代提供更多的遗传信息；也可以 3将F分组，分别接种不同生理小种的菌株，据同一家系对不同小种的抗感反应，可以推测抗病亲本对不同小种的抗病基因是否相同。

23 .抗病品种选育231 ..抗病种质资源抗源是培育抗病品种的物质基础，种质资源的发掘、收集、保存和利用是抗病

湖北稻疽病菌生理小种和水格抗疽性的鉴定及生化机制研究

育种的基础工作，其中应特别注意野生稻种质资源的开发和利用。古老的地方品种与稻瘟病菌之间有悠久的共存历史，所以其中的抗病基因可能具有更宽的抗谱，表

现持久抗性。我国的云南、湖南、太湖以及四川等地都有丰富的稻种资源：云南收集保存了近60份稻种，约占全国 00稻种资源总数的 1 0/;湖南农科所也从 18年 1 92以来发现搜集并统一编目了10 0份野生稻资源；而太湖粳稻可能是粳稻的起源之一；陆贤军等对35份四川水稻地方品种的 25抗稻瘟病鉴定结果表明，四川地方品种中存在各种抗性资源，但抗苗瘟资源多于抗叶瘟和穗颈瘟资源。抗苗瘟资源以釉粘型品种为主，而抗穗颈瘟资源以粳、糯型品种居多.高抗或抗叶瘟和穗颈瘟

或抗 (中抗)

“三瘟”的资源以粳、糯型品种居多。对抗性资源的地理分布研究发现，抗苗瘟资源分布广，而抗叶瘟和穆颈瘟资源主要分布在盆周边缘地区，其次是川西南山区，特别是多抗资源，这一点对品种合理布局也具有指导意义。这些研究都证实了这些

地方品种确实蕴藏着新的抗瘟基因和持久广谱抗源，而且有的己经得以利用培育出优质抗病品种。因此，挖掘和研究这些基因并将新基因转入生产品种中，对提高生产品种抗病性具有重要作用。

232 ..抗病育种的方法2321 ...杂交育种杂交育种是一种传统的育种方法，通过人工杂交选育和鉴定后代材料等手段， 培育出优质、高产、多抗品种。目前水稻育种上主要利用三系或两系配套技术培育杂交稻。

恢复系抗病性的研究和应用是杂交稻抗病育种的重要组成部分。 多数研究表明，目前用于杂交育种的不育系抗性较差，杂交稻的抗瘟性主要来自于恢复系。恢复系

与F之间，抗病性大多为显性遗传则为有效利用恢复系的抗病基因提供了依据。杂交稻抗瘟性杂种优势数量遗传分析表明，杂交稻的叶瘟抗性具有较强的杂种优势，遗传力高，受加性和非加性效应影响，但以加性效应为主，源于恢复系的加性效应明显重要于不育系的，而且目前生产上应用的不育系的抗瘟性都较差，所以杂交稻的抗瘟育种应以提高恢复系的抗瘟性为重点。

杂交稻新品种的抗性基因多样化，是防止稻瘟病流行、延长品种使用年限的重

要措施。朱杰等提出：广泛搜集和筛选杂交稻抗源恢复系与不同质源的不育系组配是育成抗瘟新品种的有效途径。釉型恢复系 88和密阳4的抗瘟基因遗传分析表 40 6明，二者可与不育系组配，杂交种因有显性抗性基因而表现抗性，也可将它们与其

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它优质材料杂交、回交，把抗病基因导入另外的材料中，选育具有复杂抗性模式的

多抗品种，也可用于多系品种选育。周少川等用三黄占2号和三卢占7号两个持久抗瘟常规稻品种分别与感病不育系广 A、博A组配，同样证明了杂交稻持久抗瘟育种的可行性。关于两系杂交稻，郭咏梅等研究指出：以优良两系杂交稻恢复系为公共轮回亲本，与多个抗源亲本杂交、回交，转育出具有不同抗性遗传背景的系列恢复系，再测配筛选，配制出具有不同抗性基因的系列两系杂交稻组合应用于生产，以实现抗性多样化。张君成等还指出，摸清抗瘟基因与育性基因之间的关系对育成广谱抗性的杂交组

合将更有指导意义。

2222 ...诱变育种和生物技术辅助育种诱变育种利用物理或化学因素诱导植物材料产生突变，再从中筛选出抗性突变 体以为抗病育种提供新抗源，主要有航天诱变、辐射诱变、药剂诱变等途径。

航天诱变育种是将植物种子塔载于返回式卫星，利用高空重粒子、高能粒子、 微重力和高真空等空间环境诱变因素的作用，使植物产生突变，返地种植后通过多代观察和筛选，选择能稳定遗传的有益突变体作为育种材料。

有辐诱药诱研报还对少， 9是 c y 和剂变的究道相较如R1就用'o线关射变 7射处理城特22 3/秀水3 F的干种子选育而成的 7:抗稻瘟病新种质，具有抗性强、抗谱广、抗性易转育利用等优良特性；饶志明等用0 m oL的B H喷雾处理感病品系G 7 . ml 3/ T 1幼苗进行抗瘟诱导，并应用 m N R A差别显示技术证实了B H能诱导水稻产生抗瘟 T性。

现代生物技术为 抗瘟育种开辟了一条新途径，主要方法包括组织培养和抗病基因工程技术。组织培养育种是通过组织培养，获得愈伤组织，筛选体细胞突变体， 选育出具

有一些优良性状的育种材料的一种育种方法。主要有花药培养、体细胞突体筛选以及体细胞杂交 (原生质体融合)三个途径。

转基因育种目 前主要采用基因枪转化法和农杆菌介导法，其技术路线是抗病基因克隆一一载体构建—受体转化—转化体筛选与鉴定。 98自18年第一批转基因水稻植株问世以来，转基因水稻研究已获得可喜的成绩，以基因枪法为主的水稻转

化系统逐步建立，许多重要抗性基因如X2. b Cc p B C等相继被导入 a1 P, r i, i - e n P o水稻。目前日本已经培育出抗稻瘟病转基因水稻。分子标记育种利用抗病基因和分子标记之间的紧密连锁关系，从而提高育种效 率，并为抗病基因的克隆奠定基础。

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3植物抗病机制的相关研究31 .结构杭性水稻表皮覆有一层防水的角质层 ( 蜡质、甲壳质)和附属毛，能防止病菌侵染和扩展。叶脉的木质部、维管束鞘和厚壁细胞能有效地阻止真菌的扩展。硅是水稻

生长所必需的矿质元素，水稻叶片、茎节都具有特别的硅质化表皮层，可起到防止

病菌侵入的作用。1 2 i k和A a i 9年My e dc首先报道抗稻瘟病品 2 a h种的含硅量比感病品种含硅量大，并与

1 2 9年发现品种的抗性程度随硅的施用量及其植株中硅的积累 3

量增加而提高，林也得到藏惠类似的结果。分某期和抽箱期水稻植株茎叶S 2 i含量 O与叶瘟和穗瘟病情指数呈显著负相关，S参与调节细胞壁物质的生物合成。 i硅使水稻各生育期全氮、蛋白氮、非蛋白氮含量明显降低，而全氮、非蛋白氮与叶瘟病情

指数呈正相关。王绍坤发现抗性品种的剑叶表皮硅化细胞数目木质素是维管束多。

植胞壁的组部是类结单禾分化物，学组物细重要成分，一含酚构元的然高子合其化成和结构特征决定了它们较高的化学稳定性的抗微生物降解的能力，刘学群、黄新汉、马国华研究认为在全生育期抗性品种木质素含量都有较高的趋势。

32 .诱导抗性植物在与病原物长期的共同演化过程中逐渐获得了一系列复杂的防御机制来保 护自己。从植物细胞壁到细胞内部的一系列抗性反应，细胞壁强化是第一个环节。包括木质素沉积、乳突形成及脱服体、胶滞体、侵填体的产生等，都可不同程度地阻止病原物的侵入和扩展。除木质化作用外，细胞壁中发现一种富含轻脯氨酸的搪

蛋白，它作为一种细胞壁多聚体在植物抗病中起防卫作用，至今在病原侵染的菜豆、大豆、黄瓜、马铃薯、小麦、水稻等培养细胞和植株中发现了富含经脯氨酸糖蛋白的含量增高，它的增加可提高细胞表面的强度，从而提高对病原菌的防卫作用。植物在接受诱导刺激后所发生的主要生理生化反应还有可溶性碳水化合物和酚

类物质含量增加，植物保卫素产生和积累以及多种酶活性的变化，病程相关 (R P)蛋白的产生等。酚类物质不仅可作为病原物的拮抗剂，抑制抱子萌发和菌丝生长，在某些情况下还可抑制病原物毒素及酶的产生或使其钝化.植物保卫素的抗病作用己在多种病害体系中得到研究，并且表明植保素积累的时空效应与诱导抗性效应相关联。酶类物质不只是作为单独的抗病诱导因子起作用，更多的是间接参与其它抗

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病防卫反应。如苯丙氨酸解氨酶 (A )是植保素、木质素及酚类物质合成的关键 PL

酶，其它的酶如超氧化物岐化酶(O )脂肪酸氧化酶(O )过氧化物酶(O ) SD、 LX、 PD,多酚氧化酶 (P )抗坏血酸过氧化物酶 ( P )都分别以不同方式直接或间 PO、 A X等，接地参与抗病防卫反应。

321 ..苯丙烷类代谢与抗病性的关系在5年后， a, K a根吸谢的探索 期 D

l Sa, l等据呼代变化研究了物。代 yh w iy r植感染病原菌的生理基础， 0 6年代开始，根据磷酸戊糖途径 ( M ) H P与植物抗病的紧密

联系，进一步开展了对莽草酸途径及其衍生的次生物质代谢作为抗病基础的研究。

在诱导抗性中，丙类苯烷代谢 ( ebl ope lan) M t os f yli具有重要的 a i m h an e n作用。 94 1 6年，首次发现植物感染病原菌后 P L活性明显增强现象。以后，陆续发现多种植物 A

在受到病原菌感染后P L A活力均有增高，并且与植物的抗病性有着密切关系。植物体大多数酚类物质的合成与苯丙烷类代谢密切相关，在该途径中，苯丙氨酸解氨酶

(h y li A m n Ly, ) Pe l n e m oi a e P L是关键酶， na n a a s A它催化L一苯丙氨酸脱氨基转化为反式肉桂酸。肉桂酸被肉桂酸一 4轻化酶轻基化，生成对香豆酸，然后再逐步形一成咖啡酸、阿魏酸、类黄酮化合物、木质素和一些植保素。它们与P L的活性在植 A

物体内的变动存在着伴随性，在木质素合成中有着协同变化 (章元寿等，19 ) 96许多研究认为P L A是过敏性反应代谢中起调控作用的主要酶系之一。

在 PL A活性与植物病害的关系中，大多数研究认为P L活性升高与抗病性相关 A

(许勇等， 00。 20)用亲和性的和非亲和性的马铃薯晚疫病小种分别接种寄主后发现，非亲和性组合的寄主产生的 P L的增加既快，量又大 ( A章元寿等，19 ) 96

另外，水稻感染小球菌核病后抗病与感病品 A活性变化也有差异，种PL抗病品种比感病品种的P L活性早达到高峰。这可能是抗病品种在病菌侵入后， A其酶信号易被

激活，酶量迅速增加使抗病性增强 (尹德明等， 01。 20)苹果抗轮纹病、褐斑病、黄

瓜品种抗镶刀菌所引枯萎病、小麦品种抗赤霉病等的起的研究都表明，植物受到病原菌侵染后P L活性发生明显变化并与抗性呈正相关。 A

在病毒， 细菌和线虫引起的病害方面，有关P L A活性变化的报道不多，从现在的研究结果看，倾向于支持P L A活性增强与抗病性相关的观点。从前人对 P L与抗 A病关系的研究中，归纳起来可以得出下面几点结论：寄主植物受各种病原菌感染后，普遍可以观察到P L A活性的升高，抗病品系对病原菌引起的对 P L活性的刺激作用 A大于感病品系；用病原菌毒素处理同病原菌接种感染一样，能刺激 P L活性升

高， A

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病原菌感染诱导P L A升高都表现出一个时间进程，不同的植物，不同的病原菌感染，时间进程的长短可能有差异； A活性的急剧下降可能由于细胞内 PL在诱导 P L活性 A

的同积累某钝 A的分物一时了种化PL大子质

抑制蛋白 . e 1 8 gsa” u r 9 ) ne Zc ( 6, m k El

和Bug (91, tde mt (93, a (96, e (98, r e 1 ) At g和S i 1 ) Ce- 1 ) Blt 7) gn 7 r i h 7 r c y 7 i 1 l王敬文等 ( 8) 1 2,薛应龙等 (93分别在印 9 18)度小黄瓜 (u ms ua、萝卜 Cc i agr ) u n i (ahns u) Rpa si s葵 (eahs us u av、向日 t Hln uanu) it n、马铃薯 (o nm e s ) Slu t r u, a u o m b水稻 ( r a v)中有P L内 Oy st a证实 A源抑制物质的 z a i存在。

322 ..活性氧与抗病性的关系活性氧是含氧的、反应性极强的一类小分子化合物，植物体内的活性氧有：超

氧自基 ( )单线态氧 ( 2 H0,由仇一、 ' ) 22经自由 ( H )脂氧自基 (O)和 0,基 .、 O由 R.脂氢过氧化物 (O H R O )等。活性氧主要来源于线粒体、叶绿体和一些酶促反应。由于活性氧具有极高的氧化还原活性，所以能与细胞中众多生物分子发生反应，使它们失去生物活性，造成机体损伤。

已有研究证明，在各种植物一病原相互作用中活性氧的产生是与植物抗病反应

密切相关的，1 3 Dk首次发现马铃薯被晚疫病菌感染后的瞬间，叶片的活性 9年 oe 8氧迅速产生积累，并发生过敏性反应；而对病菌感染不能引起过敏性反应的马铃薯则没有这种现象。18 Sk aa 97年 eiw亦发现水稻叶片感染稻瘟病真菌后出 z现氧化爆发，植物的氧化爆发与过敏性反应密切相关，活性氧的积累与膜脂过氧化均发生在过敏性反应之前，活性氧的水平与过敏性坏死细胞数量呈正相关。活性氧可直接攻

击膜系统中的不饱和脂肪酸，导致膜脂过氧化的发生；受稻瘟菌侵染的的水稻丙二

醛 (D ) N A含量明显升高，非亲和性互作中的发生比亲和性互作早，强度大 (葛秀春等，19)在稻瘟菌侵染水稻的抗病反应中， 98。活性氧积累快且量大；而感病反应则都基本不变，即使升高，量也小 (葛

秀春等， 00。 20)活性氧在病原体感染部位大量积累对入侵的病原体起毒害作用：对细胞壁有强化作用，木质素的合成需要活性

氧参与，同时，活性氧还诱导植保素的合成；有时，活性氧在植物的抗病防御中对植物体内的一些基因表达起调控作用，要么，直接对基因起作用，要么，间接地通过别的信息传导物质来实现。因而活性氧的积累被认为是植物抗病反应的早期特征

之一，并参与一系列抗病防卫反应的表现 (宋风鸣等，1 6. 9) 9氧化爆发时活性氧的 可能来源是细胞膜上的N D A H过氧化物酶可以产生仇和

H0,个 22另一来源是氧合酶 (i xg a简称 L X,脂 L oy n e p es O )植物发生过敏性反应时

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L X活性上升和膜脂过氧化作用增强。 O脂氧合酶在自然界里广泛存在，催化含专门

有c, 1 -二构不和酸。物， ic-,烯结的饱脂肪在植体内通常同组织中在 si 4戊 s一存着多种 L X同工酶形式。已 O有研究表明，L X在植物体内的代谢产物可以作为抗菌 O和抗虫性物质，其代谢产物中还含有活性氧和氧自由基，对细胞膜具有破坏作用，

由与物的老程抗性坏反 C f CViy lan此参植衰过和病过敏死应(r K oeC u r k o P, t s凡S se oA 19) J 90。在病害系统中，通常非亲和性组合下 L X活性诱导早、水平高；亲和 . O性组合下不诱导或诱导晚、水平低。非亲和性反应的水稻L X活性在接种后 1小 O 8

时开始上升，和7小时分别出 2 4 2现两个高峰；亲和性反应中在互作后期略有增加(葛秀春等，00。 20)番茄与菜豆叶斑病菌的非亲和性反应中，在处理后6小时开始增加， 4小时达到最大： 8而亲和性反应中处理后2小时才有较大的增加，2 4 7小时达到最大。己有研究表明，水稻氧化脂肪酸类诱导及其合成途径 ( O即L X途径)活化具有小种

特异性特点，很可能稻对稻瘟重要抗病机理是水病的之一(h HSi K 1 3 Ot, a 9 ). a h, d 9然而，前关于L X侵染诱导的分子机理及其在植物抗病中的真正作用尚未得 目 O到深入广泛的研究。因此有关该途径的生化和分子生物学研究必将从分子水平上证

明脂氧合酶在稻瘟病抗性中的作用及其作用机理的解析，为实现持久的抗稻瘟病分子育种奠定基础。人们坚信通过对活性氧的研究定会

为植物抗病基因工程提供新的策略，以提高植物自身抗病能力的方法代替当前主要的抗病措施一农药喷雾法。

323 ..抗氧化系统与抗病性的关系植物在正常状态下由于保护酶等活性氧清除系统的存在而使体内活性氧处于低 水平的动态平衡。抗氧化系统或活性氧清除系统由保护酶系和抗氧化物质两部分组

成，在植物的保护酶系中有超氧化物岐化酶 (O ) S D、过氧化物酶 (O ) P D,过氧化氢酶 ( A ) C T、抗坏血酸过氧化物酶 ( P ) A X;抗氧化物质主要包括抗坏血酸、维生素E及还原型谷胧甘肤等。这两类抗氧化系统的活性或含量在受到病原菌或诱发物处理时发生变化，并与活性氧的积累有关。

S D是最主要的活性氧清除酶类，有 9%的为 O O 0,是由 S D清除的。它催化 O

伍一转化为场和 H0。 22后者为C T等酶诱导，当S D活性下降， A O伪一歧化速度减慢，同时C T活性下降， A两方面因素可能是造成水稻幼苗膜脂过氧化的必要条件 (曹赐生等， 00。在植物一病原物互作过程中，寄主体内 S D活性在不同的植 20) O物病害系统及不同的互作类型中变化是不同的。一般由亲和性互作引起的感病反应中 S D活性升高， O但非亲和性反应中 S D活性变化不大，甚至下降。 O在水稻、玉

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米、菜豆和黄瓜的过敏性抗病反应中也观察到相似的结果，由于保护酶系统的活性

不变或下降，导致活性氧的大量积累并诱发膜脂过氧化 (朱友林，19) 96.植病学者就 O S D和 C T活性氧清除剂与植物抗病性的关系进行了许多研究， A但目前尚未得出一致的结论。

过氧化物酶 P D除了是细胞内 (O )重要的内源性活性氧清除剂，还和多酚氧化酶 (P )同属氧化酶系统.在植物品种一病原物互作发生亲和性或非亲和性反应 PO引发的多种生理生化反应中，抗病品种的过氧化物酶活性升高，感病品种活性或者

没有变化，或者升高时间延迟 (蒋选利等， 01; 20)在水稻一稻瘟病菌非亲和性互作

中， 22 H0产生和过氧化物酶活性上升快，并逐渐积累到较高的水平；而在亲和性互作反应中，H0产生和 P D酶活性上升被延迟， 22 O积累水平较低。这在水稻的超微结构观察里也得到证明，认为过氧化物酶的变化与植物抗病性呈正相关 (杨民和，郑重等，20) 02 0

当然，对过氧化物酶与抗病性的关系也有得出不同结论的，认为过

氧化物酶与 抗病性负相关 (叶钟音，陈信波等)。

324 ..同工酶技术与杭病性的关系同工酶作为一种天然标记几乎存在于所有的生物体中， 而且同工酶技术又是在分子水平上研究生物现象的一种新技术。植物同工酶与植物病害间存在密切的关系，

病原物侵染植物后，会使植物组织发生特殊的代谢变化，从而引起体内多种同工酶的改变。关于植物的抗病性与同工酶变化的关系在多种植物中已有多方面的报道，

这说明同工酶技术在植物抗病性研究中显示出很强的生命力和广阔的前景。因此，我们可以 利用同工酶的变化作为病害诊断和抗病品种选育的手段之一。同工酶既是基因产物，又是基因表达的结果，利用同工酶谱的分析方法，可以从分子水平上认识遗传基因的精确指标，又可认识基因表达的生化指标。

过氧化物酶同工酶作为筛选抗病品种的生化指标报道较多，但结论不一致。病 原菌侵染诱导受侵植物过氧化物酶活性变化的同时，常伴随着其同工酶种类的改变.

黄瓜感染霜霉病菌时，抗病品种产生两条新的 PO同工酶带和两条新的 P D同工 P O酶带，感病品种只产生一条P D同工酶带， O没有新的PO同工酶带出现 ( P李靖等， 19 )蔡新忠等认为黄瓜受霜霉病菌侵染后抗感品种的过氧化酶同工酶活性增加与 91;黄瓜抗霜霉病害有关；王瑜， 94在研究过氧化物酶谱变异与黄瓜抗病的关系中 ( 19)发现，接种后 P D同工酶带数不变，活性略有升高；徐朗莱等，(9 1 O 19 )对赤霉病

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抗性不同的五个小麦品种进行研究时发现，过氧化物酶同工酶带颜色的深浅与品种

抗病性呈正相关：王彦才 (91等研究了 1 ) 9水稻抗瘟性与过氧化物酶同工酶的关系后指出，受侵染的植株与健康植株的同工酶谱带数及迁移率没有明显差异，没有新的谱带出但过氧化物酶同工酶的活性与水稻抗瘟性密切相关：现，从上述分析可见，过氧化物酶同工酶与植物抗病性存在一定的内在联系，董雅茹认为，不同水稻抗病

品种间过氧化物酶同工酶图谱的差异很可能代表这些品种自身在抗病方面的遗传基础的差异，这种差异又是相对稳定的，可以利用水稻过氧化物酶同工酶图谱的差异来作为鉴定水稻品种抗病性的辅助手段。

醋酶同工酶作为早期筛选品种抗病性的生化指标的报道不多， 胡能书等 (95 18)曾报道水稻抗病力强的品种比抗病力弱的品种多一条酷酶同工酶带：莫饶等进

行了水稻幼苗在水分胁迫下酷酶同工酶的变化研究，发现早稻有一特征酶带与抗水分胁迫相关，并把酷酶同工酶的特异变化作为间接筛选抗早性的参考生化指标：水稻接种稻细菌条斑病菌后，感病品种的酷酶同工酶变化较大，而抗病品种的酷酶活性和同

工酶均没有太大的变化 (张晓葵等，1 4:董雅茹等 (97对大豆的根系进行了 9 ) 9 18)酷酶同工酶的分析，品种间酷酶同工酶差异甚微。

325 ..抗病蛋白的生成与抗病性的关系17年，Ga￣ i i 90 n和vn n a Lo等人分别发现了 o存在于烟草中的P R蛋白。P R

蛋白在健康植株中不存在或很微弱，当植物被病原菌侵染或诱导时，则迅速产生和积累，在蛋白电泳图谱上表现新的蛋白带或强烈增加的蛋白 P带。 R蛋白可被真菌、细菌、病毒和类病毒的感染所诱导，另外，与病原菌本身物质有关的一些物质同样可以诱导植物产生 P R蛋白，如几丁质、1 3, -葡聚糖，在植物抗病中P R蛋白参与

植物的局部和系统诱导抗性，起过敏反应的抗性株内P R蛋白强烈增加。

病程相关蛋白(aoe s-leP tn P )植病理或病理相关的环 P hg es ad e,是物在 t ni t r i R e r o境下如病原物的侵染或某些物理化学因子刺激、胁迫产生的一类诱导蛋白。在体内和体外均显示出抗真菌活性， R直接攻击病菌， P其水平与病原菌数量呈正相关，迄今为止描述的几乎所有系统获得性抗性 (A ) S R都与P R积累有关，是植物产生S R A

的要重指标。程蛋白般分病相关一被为5第二组，组为p 1 3葡糖酶，三 -,聚 -第组为几丁质酶，其余几组功能尚未完全了解，不少研究表明有抗昆虫和抗逆境的作用。几丁质酶是能水解许多病原菌细胞壁主要成分几丁质的酶，此酶在高等植物中

普遍存在。于由它对病原菌几丁水质的解破坏，故可起到防作 p .葡聚糖酶卫用。 -3 1一

湖北稻疽病菌生理小种和水稻抗疽性的鉴定及生化机制研究

能病原水解真菌细胞壁的 p,葡聚糖，一1 3一从而防止真菌危常与几丁害，质酶一起诱导形成，两种酶的作用往往具有协同性。

蔡 风鸣等， 1 5用水新忠，宋 ( 9)杨酸处理 9或用Pru r o z接种水稻幼苗， ycaa a il r e i y通过 S S E和活性 P G D PG A A E检测到4 P;种 R吴健胜等 (96选用水稻白叶枯菌 19)

不亲和互作系统，通过

双向电泳分析发现一种新的特异性诱导蛋白质和两种特异性增强蛋白质；曾富华等 (02用水稻白枯叶菌等诱导因子诱导水稻叶片及悬浮细 20 )

胞，均发现新增蛋白质谱带，显示 P R与诱导抗性密切相关。朱友林等 (00 20)选用水稻白叶枯病菌日本系统小种接种水稻，抗病品种蛋白质双向电泳产生蛋白质增强，并新增加了一个蛋白质。感病品种蛋白质增强幅度较小，没有新增加的蛋白质。

通过比较同一菌种诱导抗病和感病近等基因系以及不同毒性菌种诱导同一水稻品系蛋白质双向电泳图谱的变化，发现两个 P R蛋白在非亲和性互作中产生的时间早、速度快、数量多，与水稻对白叶枯病抗性有密切关系。有关植物体内蛋白 质含量与抗病性关系的报道也很多，在大麦与白粉病抗性研究中，非亲和性组合初期蛋白质合成加强，亲和性组合的蛋白质降低，后期才有所增加 (章元寿等， 96; 19)对水稻的持久抗瘟性生化鉴定的研究中发现，接种前后抗病和感病水稻品种叶片蛋白质含量变化均不明显，前者蛋白质含量显著高于后者(陈

信波，罗泽民等 19;在不同种粒抗性大豆品种感染 S V后可溶性蛋白 96 M含量变化中，抗性品种可溶性蛋白含量降低，而感病品种可溶性蛋白含量增加 (郑翠明等，

19)抗赤霉病程度不同的小麦品 98:种经毒素处理发现，感病小麦体内可溶性蛋白谱带发生变化，有许多蛋白带消失，抗病品种的可溶性蛋白并没有变化，研究认为感病品种消失的蛋白是寄主细胞与毒素互作有关的蛋白，也是与赤霉病致病过程相关的蛋白。毒素可能通过抑制这些蛋白，使植物的防御机制不能发挥作用，从而使小

麦感病 (史建荣等，1 80 9) 9因此，在亲和性互作和非亲和性互作中，植物防卫基因均能被诱导表达，在蛋 白质水平上，防卫基因表达产物在亲和性互作和非亲和性互作间的差异，很可能表现在产生的速度、数量及空间累积等方面。有关防卫基因的表达产物或对防卫基因表达起调控作用的蛋白质，在抗性中可能具有重要的作用。

4本研究的目的意义我国稻谷年产量占全国粮食总产量的 4%,但稻瘟病常年均可造成危害，由于 3水稻品种的高产与抗病特性、高产栽培措施与病害防治之间还难以全面兼顾，加上

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我国稻区的生态条件和耕作制度又有利于稻瘟病的发生流行，大面积推广单一水稻品种和稻瘟菌变异性大等因素，使未来较长时期内稻瘟病在我国稻

区危害流行仍然是不可避免。目前，使用杀菌剂等化学防治虽然作用迅速，效果显著，使用方法比较简单，是人类与病害作斗争的重要手段，但是，化学药剂大部分有毒，使用不当

往往污染环境，破坏环境生态平衡，农药的高残留会对人类健康产生不利影响。因此，高产、高效、优质的农业需要高投入，但高投入决不是仅仅是水、农药等，肥、而是应在技术、优良品种上等方面加大投入，这其中，抗病性研究的意义和作用就是不言而喻的。以往对稻瘟病的研究主要侧重于病原菌鉴定及侵染规律的研究，或者仅仅是从稻瘟菌或水稻一方面来研究防治稻瘟病的策略，而对寄主与病原菌相互作用的生理生化涉及较少。

本研究通过对水稻抗稻瘟病、感稻瘟病材料的对比分析，在生化水平上探讨水 稻对稻瘟病的抗病机制。为抗病基因工程提供目的基因，寻求和制定防治稻瘟病的

新策略和新措施，为了解水稻抗病基因在抗病中的功能并为克隆该基因进一步打下基础，从而为水稻抗稻瘟病的育种和抗病品系的合理、持久利用，新化学防治药物的开发，提供重要的理论和实际指导依据。