葡萄酒分析检验实验

葡 萄 酒 学 院

二OO八年

《葡萄酒分析检验》实验教学大纲

学时：36学时

实验一：葡萄酒分析常用试剂的配制及标定、葡萄酒pH值的测定

掌握分析常用试剂的配制和标定的方法，学会使用pH计。

实验二：液相色谱仪的使用及葡萄酒酒度、比重的测定（3学时）

了解液相色谱仪原理及基本操作技术，掌握比重瓶测定酒度的方法，掌握酒精计测定酒度技术，能正确使用酒精表及比重计。

实验三：气相色谱仪测定葡萄酒的酒度（3学时）

了解气相色谱仪原理及基本操作技术、学会使用气相色谱仪测定葡萄酒酒度的方法，能正确操作气相色谱仪。

实验四：葡萄酒干浸出物、可溶性固形物的测定（3学时）

掌握干浸出物测定方法及实际操作技术，学会使用手持糖量计。

实验五：葡萄酒糖的测定（3学时）

了解液相色谱仪测定糖的原理及方法，掌握斐林试剂滴定法测定糖的原理、技术方法以及注意事项。

实验六：葡萄酒总酸、挥发酸的测定（3学时）

了解电位滴定法测定总酸的原理，掌握总酸的测定方法及各类酒终点的确定方法及掌握挥发酸的测定原理及其实际操作技术。

实验七：葡萄酒二氧化硫的测定（3学时）

掌握游离二氧化硫、总二氧化硫的测定原理、技术及终点的确定方法。

实验八：葡萄酒中苹果酸－乳酸层析分析（3学时）

熟悉有机酸组分的测定原理。掌握用纸层析法分离鉴定葡萄酒中主要有机酸的技术与方法。

实验九：葡萄酒中铁的测定（3学时）

掌握邻菲啰啉比色法测定铁的原理与操作技术。

实验十：白葡萄酒中蛋白质的测定（3学时）

掌握考马斯亮兰法测定白葡萄酒中蛋白含量的方法

实验十一：葡萄酒综合分析实验（6学时）

掌握葡萄酒分析检验的一般方法及主要指标的检测方法，要求学生能独立完成葡萄酒某项指标的检测。

实验一 葡萄酒分析常用试剂的配制标定及pH计的使用

一、实验目的：

学会斐林试剂A、B液，氢氧化纳标液的配制及氢氧化纳的标定，熟练掌握pH计的使用 二、试验试剂

NaOH、苯二甲酸氢钾、酒石酸钾纳、硫酸铜、氢氧化纳、酚酞 三、操作步骤

⑴、斐林试剂A、B液的配制

斐林试剂A液：称取34.7g 硫酸铜定溶至500ml容量瓶中。 斐林试剂B液：173.0g酒石酸钾纳＋定溶至

500ml容量瓶中。 ⑵、0.05mol/L氢氧化纳溶液的配制

①、称取2g氢氧化纳定溶至1000mL ②、无二氧化碳水的制备：

量取一定量蒸馏水，加热至沸，保持沸腾状态5～10min ③、标定：

称取苯二甲酸氢钾（在105～110℃烘2h，取出在干燥器中冷却）0.3000g溶于50ml无二氧化碳蒸馏水中，加2滴酚酞，用配制的氢氧化纳溶液滴定至粉红色，保持30s不褪色。记录体积（V） ④、计算：

m(苯二甲酸氢钾）g

CNaOH （mol/L）＝

0.2042 （V－V0）

（3）5g/L葡萄糖溶液的配置：

精确称取5.0000g/L（精确到0.0001g）在105～110℃烘箱内烘干3小时，并在干燥器中干燥冷却的葡萄糖，用水定容至1000mL。 （4）、pH计的使用

①、取出复合电极和测温传感器

②、.接通电源，预热30min ③、进行pH仪的标定 A、一点标定

电极蒸馏水冲洗插入pH 4.01开关置于“ T“测定温度"PH”斜率调节至满刻度 调节“定位”至显示4.01 B、二点标定

取出电极 吸干 “ T ” 开关置于“pH插入 pH 7.0缓冲溶液中 取出擦干（测酸性溶液）插入pH4.0

取出擦干（测碱性溶液）插入pH9.0

④、标定结束后，即可进行酒样pH值的测定 先显示温度在打到pH档，显示酒样的pH值。

四、记录数据（包括原始数据及试验结果）

实验二. 高效液相色谱仪的结构、天美7890F气相色谱仪的使用及

葡萄酒酒精度的气相色谱测定方法

一、实验目的：

熟悉高效液相色谱仪的结构及其流程。

熟悉天美7890F气相色谱仪的流程、各部分结构以及操作步骤。掌握气相色谱测定葡萄酒的酒精度的方法。 二、实验原理：

样品在气相色谱仪中通过色谱柱时，由于在气固两相中吸附系数不同，而使乙醇与其他组分分离，利用氢火焰离子化检测器进行鉴定，用内标法定量。 三、仪器：

岛津高效液相色谱仪；

气相色谱仪：配有氢火焰离子化检测器。 色谱柱：Chromosrb 103 微量进样器： 四、试样制备：

标线制备：同书

将样品准确稀释4倍(或根据酒度适当稀释)，然后吸取10.00mL于10mL容量瓶中，准确加入0.50mL正丙醇内标溶液，混匀。 五、分析步骤：

1. 岛津高效液相色谱仪

保护柱检测器记录仪 2. 天美7890F气相色谱仪的使用 ①. 通气：打开空气、氢气、氮气开关 ②. 打开电源开关 ③. 设定色谱条件

柱温：（根据色谱柱及样品，温度设定在最高温度之下）200℃ 检测器：（温度应高于柱温20～30℃） 240℃ 载气流量(氮气)：40mL/min； 氢气流量：40mL/min； 空气流量：500mL/min；

设定量程 8 衰减 1

④. 观察检测器温度。当检测器温度＞100℃ 后点火。 ⑤. 基线稳定后进样（一般在30min后） ⑥. 标准曲线的绘制

⑦. 分别吸取0.3μL乙醇标准溶液，快速从进样口注入色谱仪，同时开启记录仪记录色谱图。以标样峰面积和内标峰面积比值对酒精浓度做标准曲线(或建立回归方程)。

⑧. 试样的测定：吸取0.3μL的试样按以上操作

六、结果分析计算

用试样组分峰面积与内标峰面积的比值查标准曲线得出的值(或用回归方程计算出的值)，乘以稀释倍数，即为酒样中的酒精含量。

实验三、葡萄酒（汁）比重测定及手持糖量计的使用

一、实验目的

熟练掌握比重计使用方法，及其校正方法。 学会正确使用手持糖量计的方法。 二、实验原理

比重---阿基米德定理。

手持糖量计是基于含糖溶液的折光率比例于它的浓度的原理。

三、实验器材

比重计（0.9～1.0）；手持糖量计

温度计；蒸馏装置； 量筒； 葡萄酒酒样、葡萄汁样品 四、实验步骤

1. 比重的测定

轻压比重计不接触筒壁（同时插入温平衡1～2记录温度及比重值

2. 手持糖量计的使用

①、掀开照明棱镜盖板，用柔软的绒布仔细地将折光棱镜拭净，注意不要划伤镜面。 ②、用纯净蒸馏水溶液的折光率，查明视场中的明暗分界线是否位于刻度0%，若有偏离，则可用螺丝起子旋动分刻校正螺丝，使分划尺的明暗分界线正确位于0%处。

③、用玻璃棒沾取供试葡萄汁1-2滴，进行测定 ④、记录数据

五、数据的校正 六、实验注意事项

实验四、葡萄酒酒度及干浸出物的测定

一、实验目的

掌握比重瓶的使用及用比重法测定葡萄酒干浸出物的测定方法。 二、实验原理

酒度－－用蒸馏法除去样品中不挥发性的物质，用酒精计测定酒精的体积百分含量。 干浸出物：用密度瓶法测定样品或蒸出酒精后的样品的密度，然后用密度值查表，求得总浸出物的含量。再从中减去总糖的含量，即得干浸出物的含量。 三、实验器材

附温比重瓶、万分之一天平、酒精计 四、实验步骤

1.酒度的测定（酒精计法）

①、取样；用一干净容量瓶量取100ml馏瓶量取50ml蒸馏水3次冲洗容量瓶洗液一并倒入容量瓶 ②、连接蒸馏装置

③、用100ml容量瓶接蒸馏液近95ml，用蒸馏水定容至100ml。

④、将蒸馏液倒入100ml量筒中，静止几分钟，无气泡时插入酒精计及温度计。 ⑤、记录温度、及酒精计读数

⑥、将残留液冷凉后倒入100ml容量瓶中，用蒸馏水冲洗蒸馏瓶2～3次，水一并

倒入容量瓶中，然后用蒸馏水定容至刻度。

酒度测定（比重瓶法）

比重瓶的标定

m ②、蒸馏水质量的测定

煮沸30min

瓶＋水质量：瓶＋水质量：蒸馏水 冷却（附温度计） 20±1℃恒温水浴稳定擦干溢出测管的水，立即盖上侧孔罩

称重m1

C、试样的测定

瓶＋试样: 将试样加入比重瓶，重复第二步骤，称重m2 （3） 结果计算

m2 m Am1 m

ρ20/20＝ 0 A= a

m1 m A997.0

查表得样品酒精度

2.干浸出物的测定：

①.将测定酒精度后的残留液定容至100ml。 ②.试样的测定

重复以上两个步骤，将试样（蒸馏后的残留液）加入比重瓶，称重（试样＋瓶）m2

m2 m A

③.样品比重D20/20＝ 0

m1 m A

④.D20/20×1.0018的值，查附录 C，得出总浸出物含量（g／L）。 ⑤. 干净出物＝总浸出物（g/l）－总糖 注：总糖为裴林试剂热滴定法测得 五、数据记录及计算 六、实验注意事项

实验五 葡萄酒中总糖还原糖的测定

一、实验目的

掌握裴林试剂热滴定法测定葡萄酒中总糖、还原糖的方法。 二、实验原理：

利用裴林溶液与还原糖共沸，生成氧化亚铜沉淀的反应，以次甲基蓝为指示液，以样品或经水解后的样品滴定煮沸的裴林氏溶液，达到终点时，稍微过量的还原糖将蓝色的次甲基蓝还原为无色，以示终点。根据样品消耗量求得总糖或还原糖的含量。

CuSO4＋2NaOH NaSO4 + Cu（OH）2 (

天蓝色)↓

Cu（OH）2 ＋ （深蓝色）＋H2O

4 + 4 +H20 + +Cu2O

2OH 2OH

(红色)

三、实验器材

裴林试剂A、B液；5g/l葡萄糖标液；1：1盐酸；200g/l 氢氧化钠；pH试纸 白葡萄酒 红葡萄酒 四、操作步骤

（1）裴林氏A、B液标定 预备试验：

取裴林氏A、B液各5.00mL于250mL三角瓶中，加50mL水，摇匀，在电炉上加热沸，在沸腾状态下用制备好的葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色将消失呈红色时，加2滴甲基蓝指示液，继续滴至蓝色消失，记录消耗的葡萄糖标准溶液的体积(V1ml)。 正式试验：

取裴林氏A、B液各5.00mL于250mL三角瓶中，加50mL水和比预备试验少1ml葡萄糖标准溶液，加热至沸，并保持2min，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾态下于1min内用葡萄糖标准溶液滴至终点(消耗葡萄糖标准液，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。

（2）总糖测定样品制备

吸取一定量的样品容量瓶中（稀释使样品中总糖含量0.2～0.4g）＋ 5ml（1:1）68±1℃水浴上水解15min 冷却用200g/L氢氧化钠溶液中和至中性后定容（用pH试纸）

（3）还原糖样品的制备：将样品进行稀释，使其含糖在（2～4g/L），如使用干型酒则直接使用酒样。

（4）样品的测定

预备试验：裴林试剂A、B液各 250ml三角瓶中加水50ml 7.5ml试样 在沸腾状态下用5g/l的葡萄糖标液滴定至 2继续滴定至蓝色消失，记录体积。

正式试验：裴林试剂A、B液各 250ml加水加入

7.5ml试样＋比预备试验少1ml的葡标液5g/l的葡萄糖标液滴定至 蓝色消失成红色时 加2 五、结果计算：

mF＝ v

1000

总糖或还原糖含量g/l ＝总糖或还原糖含量g/l ＝六、实验注意事项

F G V1

稀释倍数 1000 V

C葡标液 （V标定消耗的葡标液 V测定试样消耗的葡标液）

稀释倍数

V取样体积

实验六 葡萄酒中总酸、挥发酸的测定

一、实验目的

了解葡萄酒中总酸、挥发酸的测定意义，熟练掌握用指示剂法测定总酸的方法及水蒸气蒸馏法测定挥发酸的方法。 二、实验原理：

总酸：利用酸碱滴定原理，以酚酞作指示剂，用碱标准溶液滴定，根据碱的用量计算滴定酸含量，以试样所含主体酸表示。

挥发酸：运用水蒸汽的带馏法，将挥发酸全部都拖带到蒸馏液中，然后用碱标准溶液进行滴定，用酚酞作指示剂，经过计算与修正得出样品中挥发酸的含量。 三、实验器材

氢氧化钠标液、酚酞、挥发酸装置、电炉、干白、干红酒样 四、实验步骤

（1）、总酸的测定： ①、吸取样品2mL(取样量可根据酒的颜色深浅而增减) 250ml三角瓶 50ml蒸馏水＋2滴酚酞（保持30s不变色）记录体积。

同时作空白试验。

②、计算

C （V滴定－V空白） 0.075

1000 总酸（以酒石酸计）＝

V样

（2）挥发酸的测定

①、安装水蒸气蒸馏装置

在蒸汽发生瓶内装入中性蒸馏水，其液面应低于内芯进汽口3cm，而高于B中品液面。 样品10.00mL加入内芯中， 把内芯插入，按上筒形氮球，将250mL三角瓶置于冷凝器下口，接收馏出液。

②、蒸馏

全部安妥后先打开蒸汽发生瓶的排汽管 2min后夹紧排气管，使蒸汽进入B中进行蒸馏待馏出液达三角瓶100mL标记处，先放松排气管，再关闭电炉停止蒸馏取下三角瓶，用于样品的测定。

③、测定

将馏出物加热至沸(以去除二氧化碳，但沸腾时间不得超出30秒钟) 加2滴酚用氢氧化钠标准溶液滴定至粉红色，30s内不变色即为终点。

④、结果计算

挥发酸（以醋酸计）g/l＝

CNaOH VNaOH 60

V样

五、数据记录及计算 六、实验注意事项

实验七、苹果酸的层析分析

一、实验目的

熟练掌握葡萄酒苹果酸－乳酸发酵的层析监控的方法，学会对层析结果进行分析。 二、实验原理

试样以正丁醇为流动相，在饱和水蒸汽的滤纸上直接单向展开，用溴酚蓝显色，根据有机酸在两相中分配系数的不同将有机酸分离开。 三、实验器材

层析缸、层析滤纸、展开剂、标样、酒样 四、实验步骤

⑴、滤纸的准备：

⑵、将配制好的展开剂装入层析缸内，封严。 ⑶、点样：

在离滤纸下端4～5cm处滴上待分析的样品，每滴样品之间的间距为3～4cm；最中间的一滴为苹果酸标样，用作对照；每滴样品在滤纸上的直径不能超过5mm。将滤纸轻轻放入层析缸内，使滤纸不能触及层析缸的内壁，样品滴亦不能浸入展开剂，然后盖严密封。 ⑷、展开（3~4小时） ⑸、 干燥

展开剂移动到离滤纸顶部1～2cm时，滤纸取出并用夹子固定在一铁丝上进行干燥。在干燥过程中，滤纸的颜色由黄变绿再变蓝，一些黄色斑点就是相应的有机酸。 ⑺、计算出相应酸的Rf值 五、 结果分析

画出层析结果图，并进行分析。 六、 实验注意事项

实验八、直接碘量法测定葡萄酒中游离二氧化硫和总二氧化硫

一、 实验目的

了解葡萄酒中二氧化硫测定的意义，熟练掌握碘量法测定二氧化硫的方法。 二、 实验原理

游离二氧化硫

原理：利用碘可以与二氧化硫发生氧化还原反应的性质，用碘标准溶液作滴定剂，淀粉作指示液，滴定样品中二氧化硫的含量，反应式如下： I2+ SO2+ 2H2O = 2I- +SO2－4 + 4H＋ 总二氧化硫

原理：在碱性条件下，结合态二氧化硫被解离出来，然后再用碘标准溶液滴定，得到样品中结合二氧化硫的含量。 三、 实验器材

碘量瓶、1:3硫酸、碘标液、淀粉指示剂 四、 实验步骤

游离二氧化硫的测定：

⑴、吸取25.0mL 20℃样品 250mL碘量瓶中＋（少量碎冰块）＋1mL淀粉指示液＋5mL硫酸溶液。

⑵、 用碘标准溶液迅速滴定至淡蓝色，保持30s不变即为终点，记下消耗的碘标准溶液(V)，同时作空白试验

总二氧化硫的测定

取25.00mL氢氧化钠溶液于250mL碘量瓶中，再准确吸取25.00mL 20℃样品，并以吸管尖插入氢氧化钠溶液的方式，加入到碘量瓶中，摇匀，盖塞，静置15min后，（再加入少量碎冰块）、1mL淀粉指示液、10mL硫酸溶液，摇匀，用碘标准溶液迅速滴定至淡蓝色，30s内不变即为终点，记下消耗的碘标准溶液的体积(V)。

以水代替样品做空白试验，操作同上。

五、 结果计算

游离二氧化硫（mg/l）X＝

总二氧化硫（mg/l）X＝六、 实验注意事项

C碘液 (V V0) 32

1000

25

C碘液 (V V0) 32

1000

25

实验九 邻啡络林比色法测定葡萄酒中的铁

一、实验目的：

了解测定葡萄酒中铁的意义，熟练掌握邻啡络林比色法测定铁的操作方法。 二、实验原理：

处理后的试样中，三价铁离子在酸性条件下被盐酸羟胺还原成二价铁离子，与邻啡罗啉作用生成红色螯合物，其颜色深浅与铁含量成正比，用分光光度法进行含铁量的测定。其反应式如下：

2Fe3+ + 2NH2OH.HCl →2Fe2+ +N2 +H2O +4H+ +2Cl— Fe2+ + 3 C12H6N2 → ［Fe(C12H6)3］2+

三、实验器材：

紫外可见光分光光度计、凯氏烧瓶、试剂等 四、实验步骤：

①、打开紫外可见光紫外可见光分光光度计电源，预热30min ②、试样的制备

准确吸取1.00mL样品(V)(视含铁量增减)于10mL凯氏烧瓶中，置电炉上缓缓蒸发至近干，取下稍冷后，加1mL浓硫酸(根据含糖量增减)、1mL过氧化氢，于通风厨内加热消化。如果消化液颜色较深，继续滴加过氧化氢溶液，直至消化液无色透明。稍冷，加10mL水微火煮沸3～5min，取下冷却。同时做空白试验。 ③、、铁标准系列的配制

吸取铁标准使用液0.00、 0.20、 0.40、 0.80、 1.00、 1.40mL (含0.0、2.0、4.0、8.0、10.0、14.0μg铁)分别于6支25mL比色管中，补加水至10mL，加5mL乙酸-乙酸钠溶液(调pH至3～5)、1mL盐酸羟胺溶液，摇匀，放置5min后，再加入1mL邻菲口罗啉溶液，然后补加水至刻度，摇匀，放置30min，备用，该系列用于标准工作曲线的绘制。 ④、标线的测定

在480nm波长下，测定标准系列的吸光度。根据吸光度及相对应的铁浓度绘制标准工作曲线(或建立回归方程)。 ⑤、试样测定

试样及空白消化液用氨水中和至试纸显蓝紫色加5mL乙酸-乙酸钠溶液补加水至加1mL盐酸羟胺溶液，摇匀，放置5min后，再加入1mL邻菲罗啉溶液，然后补加水至刻度，摇匀，放置30min，测出的吸光度A，从标准工作曲线上查出酒样中铁的含量(或用回归方程计算)。

五、结果计算：

湿法消化的计算

X （mg/l）=

六、实验注意事项

A A0

V

实验十 考马斯亮蓝G-250比色法测定葡萄酒中的蛋白含量

一、实验目的：

掌握考马斯亮蓝G-250比色法测定葡萄酒中的蛋白含量的方法及操作方法。 二、实验原理；

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内(0～1000μg/mL)，蛋白质—色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量分析。 三、实验器材：

紫外可见光分光光度计、白葡萄酒 四、操作步骤：

①、标线的制作

0~100标线和0～1000标线的制作

0～100μg/mL标准曲线溶液配制表

管号 1 2 3 4 5 6 1000μg/mL牛血清白 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10

蛋白原液量(mL)

蒸馏水（ml） 1.0 各管蛋白质含量 0

(μg/mL)

0.98

20 0.96 40 0.94 60 0.92 80 0.90 100

0～1000μg/mL标准曲线溶液配制表

管号

1000μg/mL牛血清白 蛋白原液量(mL)

6 0 7 0.2 0.8 200

8 0.4 0.6 400

9 0.6 0.4 600

10 0.8 0.2 800

11 1.0 0.0 1000

蒸馏水（ml） 1.0 各管蛋白质含量 0

(μg/mL)

分别准确吸取上表所配各管溶液0.1mL 分别加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂 转混合；放置2分钟 595nm下比色；记录各管的消光值(吸光度)。以消光值为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制0～1000μg/mL标准曲线。 ②、酒样中蛋白质的测定： 在10mL具塞刻度试管中，加入待测试样液0.1mL(需做重复)，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2分钟后；在595mm下比色，记录其消光值A，最后通过标准曲线查得所测试样中蛋白质含量(μg/mL)，以1号试管作空白。

五、结果计算：

酒样中蛋白含量可根据标线查出

六、实验注意事项：

实验十一 葡萄酒综合实验操作考试

—— 葡萄酒理化质量综合实验操作

一、实验目的：

掌握葡萄酒分析检验的一般方法及主要指标的检测方法，要求学生能独立完成葡萄酒指标的检测，对葡萄酒的理化质量做出评价。根据学生的操作情况给出相应的成绩。

二、实验器材：

电炉、酒精计、比重计、蒸馏装置、挥发酸装置、碘量瓶等

三、实验样品：

*****葡萄酒 四、同组人员及分工 五、操作步骤： 1.试验方法

①、葡萄酒酒精度的测定

测定方法： 测定人： 测定结果：

②、葡萄酒中还原糖的测定

测定方法： 测定人： 测定结果：

测定还原糖原始数据

测定人

③、葡萄酒中挥发酸的测定

测定方法： 测定人： 测定结果：

挥发酸测定原始数据 测定人

④、葡萄酒中总酸的测定

测定方法： 测定人： 测定结果：

总酸数据 测定人：

⑤、葡萄酒中游离二氧化硫的测定

测定方法： 测定人： 测定结果：

⑥、 葡萄酒中总二氧化硫的测定

测定方法：

测定人：

测定结果：

总二氧化硫测定原始数据 测定人：

六、结果计算：

记录实验数据并计算实验结果，对结果做出评价。

测定结果：（表）

评分标准：

综合实验总分：100分

说明：任课教师可根据每个人的实验过程中的具体操作，可在以上评分标准的基础上适当调整。