酶基因的克隆与

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山东农业科学

Sadn gch r c ne hn ogA r u ua Si cs i l e

20 05年第 2期

番茄果实蔗糖磷酸合成酶基因的克隆与序列分析孙丽萍-王秀峰杨建平于明礼于喜艳H,,,,(. 1山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 2 11;.州职业学院， 7082滨山东滨州 262 ) 564

摘

要：据 G n ak已登记的番茄、根 eBn中马铃薯等蔗糖磷酸合成酶基因的保守序列设计特异引物，用采

R—e T P R方法，番茄自交系 2—l果实总 R A中克隆到目的基因的全长 cN。序列分析表明，与 G n从 o 9 N DA它 e-

Bn ak中登记号为 A 0 11 B526的番茄蔗糖磷酸合成酶基因高度同源，核苷酸序列的同源性为 9%。该基因已在 8Gn ak中注册，记号为 A 763。 eB n登 Y 249

关键词：番茄；T— C; R P R蔗糖磷酸合成酶；克隆；序列分析中圈分类号：7;612 Q 8￥4 .文献标识号： A文章编号： 0— 9220 )2 OO o 1 1 44 (050一 O8一 4 0

Cl n n n e u n i g o ma o fu ts c 0 e o i g a d s q e cn fTo t r i u r s1h0 pl t y姐口 s￣ es n II 一 一,

S e e g ne一

S N i ig W ANG u— fn z YANG Ja U L—p n I Xi eg in—pn‘ ig,YU Mig—l, U—yh n i Y Xi a‘,

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g n s rgs

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s ta ee.hs ac s u brs B 526 l eehdbe g t di G n ak neac8 nm e yhs gn w oe ce m e i A 0 11 .nign a enr s r eBn . l ce8 u br n e s n s e e n i e i A 2 4 9. s Y7 6 3 Ke r s T mao y wo d o t,RT— P R,S coe P op ae S nh e lnn e u rs h sh t y ta,C o ig,S u n ig s q e e cn

蔗糖磷酸合成酶 (ur e popa n a, se 6— h ht s t e o s e yh s

s s是调控植物碳同化和分配的关键酶之一， P)催化果糖和尿苷二磷酸葡萄糖形成蔗糖和尿苷二磷酸。S S活性的高低， P影响蔗糖的合成能力和光合同化的碳在淀粉和蔗糖之间的分配【。目前， l】 对于绿色光合组织中 S S的研究已经很深人， P但

1材料与方法供试番茄为番茄自交系 2 0—1; N e 9 R APR( M ) e . Ktp C A V V r 1 i U m—TV c r T N连 2, et和 4D A o

接酶购自上海博亚生物技术有限公司；a a aL T K R ATq am,

G l N r m n R cvr Kt自 e D A Fa et e e i购 g o y

对于其在非光合组织，如鳞茎和果实中的作用研究则较少。在番茄中，P S S不仅调控叶片的碳代谢，而且对于果实竞争同化物的能力，实的糖分果组成及含量具有重要的调节作用【。为了充分 2“】了解 S S的结构及其在番茄果实的产量形成和品 P质方面的作用，很有必要对其基因进行克隆，为 S S因的开发利用工作奠定基础。

P基

大连宝生物工程有限公司；大肠杆菌 Dia由山 t S 东农业大学生命科学学院提供。 取转色期的番茄果实提取总 R A, N提取方法参照文献【。根据 G n ak中登记的番茄、 5】 e Bn马铃薯等 SS基因的保守序列设计上游引物为 5一 P’G A A G C G A A G T一3和下游引物为 G G TG G GA T A’5一T T C T A C G A T T’ C C A G A C G AC G C一3。按’ R A N

收稿日期：O4 2 2 2O—1— 2作者简介：孙丽萍(95。。 1一)女硕士研究生。 7主要从事生物技术与蔬菜育种研究。 *通讯作者： m i qkn@sa. uc E— a: gog due .n l d8

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P R A V V r. Kt剂盒说明书进行逆转录： c ( M ) e 1 i试 2

采用扩增效率高和保真性好的 TK R A Tq, a a aL aT M结果扩增出一条特异性较强的目的带，用普通而

取 1 l约 lg番茄果实总 R A于 85 ( t) t N .t菌双蒸 d无水中，2 7℃水浴 1rn立即置冰上 2 i,人 0 i, a mn后加1× RNA C fe/, 2 0 P R Bu r 2A 5 mmo/ CI 4d, l L Mg 2 t

Tq则没有扩增出带。扩增产物经 I%谅 a时， . 0脂糖凝胶电泳检查，在约 3 3b处有一条带， .l【片段大小与预期的一致( 2。图 )l 2

1m o Ld T , ee eTasr t e( U ) 0 m l N P2 R vr r c p/ s n i￣ 5/ 1l R a n i t .t , N s I bo 05 e h ir a和 Oi ( T lo d )一A at g dp r o

P m rll置于 P R仪中，应条件为 4 r e t。 i t C反 2【 c=3 rn 9℃ 5 i,℃ 5 i。逆转录反应完成后， 0 i, a 9 mn 5 mn 向反应体系中加入下列成分： a a aL aT TKR ATq M(U t ) .t,0×L C u e 1( p s 5/ 10d 1 d A P R Bf r I M l) u

4 3

l,t o L上游引物 6, p o L下游引物 0 4 ml t/ t 4 ml d/

6 l灭菌双蒸水 5 t。总体积为 10。P R反 I, t 7 d 0t C d应参数为 9℃预变性 5 i,

4 m n随后 9℃ l i,2【 4 mn 6 c=1 i。2 4 i,2个循环后，2 mn 7℃ rn 3 a 7℃再延伸 1mn 0 i。目的片断的回收按 A a s e D A Fam n gr e l N r et o G g

●I 6 1 b p -l 2 3 4 5

1一HidⅢ D A Ma r 2果实总 R A的 R . n N ￣e . N T—P R产物 C

图 2番茄果实 SS因 R P R产物 P基 T— C

23 T—P R产物的克隆 . R C

R cvr Kt明书进行。 P R产物纯化后， eoey说 i G直接与 pC U m—TV c r et连接，用热激法转化大肠杆 o采菌D S H a感受态细胞。感受态细胞的制备采用 C C法【。取 2 0 1液涂布于含 x—g aI 6 2】 0￣菌 a 1和

R—P R产物纯化后， T C直接与 p C U m—TV c e. t连接，化大肠杆菌 D S,白斑筛选获得 o r转 Ha蓝26个白斑。随机挑取 4个克隆提取质粒， C 1 PR结果显示均为阳性 ( 3,表明 R图 )这 T—P R的产 C

物已克隆到载体上

Ir P G的筛选培养基 ( A p平板上，7培养含 m) 3℃ 1h, 6后随机挑取 4个白色菌落，别接种于加有分 A p5 m/ m 0 g L的 L B液体培养基中，7 3℃培养过夜。 按碱裂解法少量提取质粒。以质粒 D A为模板 N进行 P R鉴定， C委托上海博亚生物技术有限公司测定 D A序列。 N

2结果与分析2 1 R A的提取 . N

13 4 5为电绳予的 P RJ… C 物 2为—Hi 1 D ￣e n I NA Ma r d 1

—图 3重组质粒 P R鉴定 C

图 l所提 R A的电泳结果。从中可以看是 N

24 SS基因 e N . P D A的序列分析

出所提 R A完整性很好，降解。经紫外分光光 N无度计测定， D, O 2=20,到了 R O ./ D8￣ o 0 .1达 T—P R C对 R A的要求 Nl 2

将所得目的克隆的重组质粒纯化后进行序列

测定，结果如图 4图 5、。测序结果表明，所克隆的eN D A长 37b, 33 p编码区序列长 36b, 12 p编码 15 04

个氨基酸。与 G n ak中的同源序列相比较， eB n本研究所分离的 c N D A与序列号

为 A 0 11 B 526的番

一1番茄 2 . o一1 N ( O3t 2番茄 2—1 N ( 0 5 ) 9R A约 . g t) . 0 9R A约 . m

茄 SS基因核苷酸序列的同源性为 9%,明该 P 8说 eN D A为番茄果实 SS基因 e N在 G n ak中 P D A。 eBn的登记号为 A 76 3。 Y 24 9

3结论与讨论3 1番茄果实 SS基因序列在品种间存在差异 . P

圈 1番茄果实总 R A N

本实验是参考番茄、马铃薯等 S S基因的保 P守序列，设计引物，克隆番茄果实 SS基因的。结 P果发现，从番茄自交系 2一l 0 9中得到的果实 SS P基因序列与来自其它品种番茄的 SS基因序列存 I在一定的差异。基因的eN本 D A核苷酸序列与9

22 S s基因的 R . P T—P R扩增 C

以番茄果实总 R A为模板，行 R N进 T—P R C扩增。由于考虑到所扩增片段较长 (于 3 b。大 k )而普通 Tq最适的扩增范围在 2b之内， a k本实验

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C G r A C A A( 33 G T C T G G 37 )

圈 4番茄果实 S s基因 c N P D A序列1 0

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图 5番茄果实 S S基因推导的氦基酸序列 I

G n ak中的登记号为 A 0 1 1 e Bn B 52 6的番茄 S S因 P基的同源性为 9%,登记号为 A 0 18番茄 8与 F 77 6的

糖的输出库变大…。通常，光合组织如鳞茎和非果实中，P S S的活性较低。但越来越多的实验表

S S因的同源性为 9%, P基 7其差异应该是由于品种不同而造成的。32番茄果实 S S基因全长 c N . P D A的获得高质量的 m N R A是获得全长 c N D A的前提，

明，P SS在非光合组织中也具有重要作用， P S S的活性有潜在的对发育过程中如开花、果和源一结库关系的影响，已被一些 SS正义转化植株的这 P表现所证实。S S P活性的高低还影响果实的糖分

以不完整的 m N R A为模板，只能反转录成短切的 eN D A

片段。本实验采用异硫氰酸胍一苯酚一氯仿一步法分离纯化 R A将变性和抽提两个步骤 N,并人一个操作中，很大程度上简化了实验程序，在 避免了烦琐操作所可能引起的 R ae降解及污 Ns的染，结果所提 R A质量很高。在反转录以后的 NP R扩增时，初我们采用的 D A聚合酶是普通 C最 NTq做了一段时间始终没有扩增出来，来考虑 a,后到目的片段较长， 30 b为 30 p左右，而普通 Tq最 a

组成和积累。在番茄、瓜和香蕉等果实的成熟香过程中，蔗糖的积累与 SS活性之间有直接的关 P系，但其机理并不清楚[ 9。目前，于果实 SS 7】 -对 P的研究较少。为了检测番茄果实成熟过程中 S S P基因的表达规律及番茄果实 SS基因正义转化株 P的性状表现，我们克隆了本基因，为以后的工作奠定了基础。参考文献:

适扩范在0b内因改扩效 …的增围 2 p,此用增率 0艺 0高和保真性好的 TK R A a a aL 瑚结果只扩增了次，扩增出特异性很强的目的带，明便说一

y毗 H 。’ ==,.

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ioe eea t von t . ua fxr ea nlr asn a rdepe… Jrl E e n d lv dl seiln e on pi t o m l . Ba,0,4 8: 1—8 on 2 35(9 13 1 0 ty 0 3 ) 8 2

L M长段增面实有 A在片扩方确具优 T势。本实验没有采用常用的 R C A E方法克隆全长

:.

8 i—hp￣sts J Pn,9。3 5— 9 U￣ p s yhe] lt 172: 3 2 . C6 oh na[ .aa 9 0 2 5 C

而获得了成功，说明在获得高质量的 R A的前提 N

CⅨh y -u￣ aite,?,凹毗 3 n e Q o,Hycnh TbF c, 0] n Ndoo H y

下，化验优实体系，接基因上和游的直根据的游下保守序列，设计特异引物，扩增全长 e N D A有时是可行的，如果辅以措施，消除 m N R A中可能有的特

liirfo蜘[ . Eee 0二 ao d ag t n d n n t s t]J af p t 伽 l rn o i a lBa 9 0 3: 5 7 . on 1 95( 5 7—9 ty 9 3)8 1 oefr

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殊二级结构的影响，消除在逆转录过程中对I N n A R模板的降解，则成功的可能性会更大。33 SS的功能研究 . P

… .uao x r。 Ba,01 2 5 8—8. Jrl E e on 2。 ( 8 8 8 on pi f ty 0 5 3 ) 1 9 C赵宜，耀荣 绍一种新的R A 5双吴 3介 N提取方法[ J遗传，][ 6] 3 3.克 3 8弗里奇 3 7-

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T曼尼阿蒂斯 .子克隆指 .分

SS P催化果糖和尿苷二磷酸葡萄糖形成蔗糖

南[]金科黎 M .雁，盂枫译 .北京：科学出版社。 9,一 1 25 9 5

和尿苷二磷酸，是调节植物碳水化合物代谢的关

,‘、

.

键之。 S性适增，对株体酶一 S活的当强可植总 P的碳同化产生积极的影响。SS主要是在叶片中 P促进蔗糖的形成，活性高低与叶片的光合速率其有定的相关性。C al发现，入玉米 SS基 hr s e转 P一

j: h:[ 8 NL。

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c8auut mors]P th i,9。94. mec mlnt a i J l yo 1 2 9:4 c a go tft . a P￣i 9 i u[ n 3H es,Ir .一lp ts. r P r M s b c I aD p l。y Ih n t88 . v ade in 0。一 l enad e Bemn协 f 眦i j 1 dcj t且。 a n o

因的烟草与对照相比：同叶龄的叶片中 SS活不 P性均比对应的对照叶片中的高，其是幼叶和老尤叶中活性显著增高，幼叶和老叶的光合性能增强，

d epg u ml (u m e L)J. lth i eli s enC uiml .[ P yd von m k o c s o ] a P￣ n[ 9]。 ni 8B R。L _0FM。 a.B I . 丑o l毗 1 a一

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老叶的衰老被延缓，功能叶中蔗糖的合成增加，蔗

【 lt 17 0:3 2 J Pn 9 3 8— 8]

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