番茄果实蔗糖磷酸合成酶基因的克隆与序列分析

酶基因的克隆与

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山东农业科学

Sadn gch r c ne hn ogA r u ua Si cs i l e

20 05年第 2期

番茄果实蔗糖磷酸合成酶基因的克隆与序列分析孙丽萍-王秀峰杨建平于明礼于喜艳H,,,,(. 1山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 2 11;.州职业学院， 7082滨山东滨州 262 ) 564

摘

要：据 G n ak已登记的番茄、根 eBn中马铃薯等蔗糖磷酸合成酶基因的保守序列设计特异引物，用采

R—e T P R方法，番茄自交系 2—l果实总 R A中克隆到目的基因的全长 cN。序列分析表明，与 G n从 o 9 N DA它 e-

Bn ak中登记号为 A 0 11 B526的番茄蔗糖磷酸合成酶基因高度同源，核苷酸序列的同源性为 9%。该基因已在 8Gn ak中注册，记号为 A 763。 eB n登 Y 249

关键词：番茄；T— C; R P R蔗糖磷酸合成酶；克隆；序列分析中圈分类号：7;612 Q 8￥4 .文献标识号： A文章编号： 0— 9220 )2 OO o 1 1 44 (050一 O8一 4 0

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蔗糖磷酸合成酶 (ur e popa n a, se 6— h ht s t e o s e yh s

s s是调控植物碳同化和分配的关键酶之一， P)催化果糖和尿苷二磷酸葡萄糖形成蔗糖和尿苷二磷酸。S S活性的高低， P影响蔗糖的合成能力和光合同化的碳在淀粉和蔗糖之间的分配【。目前， l】 对于绿色光合组织中 S S的研究已经很深人， P但

1材料与方法供试番茄为番茄自交系 2 0—1; N e 9 R APR( M ) e . Ktp C A V V r 1 i U m—TV c r T N连 2, et和 4D A o

接酶购自上海博亚生物技术有限公司；a a aL T K R ATq am,

G l N r m n R cvr Kt自 e D A Fa et e e i购 g o y

对于其在非光合组织，如鳞茎和果实中的作用研究则较少。在番茄中，P S S不仅调控叶片的碳代谢，而且对于果实竞争同化物的能力，实的糖分果组成及含量具有重要的调节作用【。为了充分 2“】了解 S S的结构及其在番茄果实的产量形成和品 P质方面的作用，很有必要对其基因进行克隆，为 S S因的开发利用工作奠定基础。

P基

大连宝生物工程有限公司；大肠杆菌 Dia由山 t S 东农业大学生命科学学院提供。 取转色期的番茄果实提取总 R A, N提取方法参照文献【。根据 G n ak中登记的番茄、 5】 e Bn马铃薯等 SS基因的保守序列设计上游引物为 5一 P’G A A G C G A A G T一3和下游引物为 G G TG G GA T A’5一T T C T A C G A T T’ C C A G A C G AC G C一3。按’ R A N

收稿日期：O4 2 2 2O—1— 2作者简介：孙丽萍(95。。 1一)女硕士研究生。 7主要从事生物技术与蔬菜育种研究。 *通讯作者： m i qkn@sa. uc E— a: gog due .n l d8

酶基因的克隆与

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P R A V V r. Kt剂盒说明书进行逆转录： c ( M ) e 1 i试 2

采用扩增效率高和保真性好的 TK R A Tq, a a aL aT M结果扩增出一条特异性较强的目的带，用普通而

取 1 l约 lg番茄果实总 R A于 85 ( t) t N .t菌双蒸 d无水中，2 7℃水浴 1rn立即置冰上 2 i,人 0 i, a mn后加1× RNA C fe/, 2 0 P R Bu r 2A 5 mmo/ CI 4d, l L Mg 2 t

Tq则没有扩增出带。扩增产物经 I%谅 a时， . 0脂糖凝胶电泳检查，在约 3 3b处有一条带， .l【片段大小与预期的一致( 2。图 )l 2

1m o Ld T , ee eTasr t e( U ) 0 m l N P2 R vr r c p/ s n i￣ 5/ 1l R a n i t .t , N s I bo 05 e h ir a和 Oi ( T lo d )一A at g dp r o

P m rll置于 P R仪中，应条件为 4 r e t。 i t C反 2【 c=3 rn 9℃ 5 i,℃ 5 i。逆转录反应完成后， 0 i, a 9 mn 5 mn 向反应体系中加入下列成分： a a aL aT TKR ATq M(U t ) .t,0×L C u e 1( p s 5/ 10d 1 d A P R Bf r I M l) u

4 3

l,t o L上游引物 6, p o L下游引物 0 4 ml t/ t 4 ml d/

6 l灭菌双蒸水 5 t。总体积为 10。P R反 I, t 7 d 0t C d应参数为 9℃预变性 5 i,

4 m n随后 9℃ l i,2【 4 mn 6 c=1 i。2 4 i,2个循环后，2 mn 7℃ rn 3 a 7℃再延伸 1mn 0 i。目的片断的回收按 A a s e D A Fam n gr e l N r et o G g

●I 6 1 b p -l 2 3 4 5

1一HidⅢ D A Ma r 2果实总 R A的 R . n N ￣e . N T—P R产物 C

图 2番茄果实 SS因 R P R产物 P基 T— C

23 T—P R产物的克隆 . R C

R cvr Kt明书进行。 P R产物纯化后， eoey说 i G直接与 pC U m—TV c r et连接，用热激法转化大肠杆 o采菌D S H a感受态细胞。感受态细胞的制备采用 C C法【。取 2 0 1液涂布于含 x—g aI 6 2】 0￣菌 a 1和

R—P R产物纯化后， T C直接与 …… 此处隐藏：11336字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……