rpm，16~18 hr，培养至OD600值>0.8。

（2）1,000 g离心5 min，弃上清。用剩余的5 mL左右残液重悬细胞。

（3）室温水浴融化冻存的文库（约1 mL），轻柔震荡，留取10 L文库用于文库滴度测定（文库滴

度测定方法见后）。

（4）快速将步骤2和步骤3的两种液体混合到2 L的烧瓶中并加入45 mL 2ХYPD/Kan（Kan50 g/mL）

轻柔震荡；用1 mL 2 YPD/Kan冲洗装文库的离心管两次，并将冲洗液加入到烧瓶中。 （5）30 ℃过夜孵育（20~24 hr）并轻柔震荡（30~50 rpm）。

（6）将杂交混合液转移到一无菌离心瓶中，1,000 g离心10 min，弃上清。再用50 mL 2×YPD/Kan

冲洗杂交瓶两次，将两次冲洗液混合在一起重悬细胞。

（7）1,000 g离心1 0 min，弃上清。用10 mL的0.5 YPD/Kan重悬细胞，并估算重悬后的总体积，

铺板。

（8）倒置平板于30 ℃孵育8~21天直到克隆出现。

（9）挑取阳性克隆于300 L YPDA和150 L消毒甘油的混合液中，冻存于-80 ℃。 阳性克隆验证：

（1）用接种环挑取单个阳性克隆接种到新的SD/-Trp/-Leu/-His/ X-Gal 平板上，30 ℃倒置平板孵育。 （2）待阳性克隆长出后，再用接种环挑取单个阳性克隆，接种到新的SD /-Trp/-Leu/-His/X-Gal 平板

或SD/-Trp/-Leu/-Ade/ -His/X-Gal 平板上，倒置平板于30 ℃孵育。

（3）挑取单个阳性克隆于5 mL YPDA/Kan培养基中30 ℃，250~270 rpm振摇12~16 hr。 （4）使用酵母质粒微量抽提试剂盒提取质粒。

（5）将提取到的质粒混合物（BD/bait、AD/cDNA）采用经典转化法转化DH5 大肠杆菌，铺LB抗

生素平板。LB平板中的抗生素与AD/cDNA载体所带的抗性一致，这样最终得到的克隆只含有AD/cDNA。

（6）挑取单个阳性克隆于5 mL LB培养基（含相应抗生素）中37 ℃，250~270 rpm振摇12~16 hr。 （7）提取质粒，做PCR鉴定。

（8）将pGADT7-cDNA表达质粒转入AH109酵母株中将pGBKT7-bait表达质粒转入Y187酵母中，

待克隆长出对带有AD-文库蛋白的AH109酵母克隆进行自激活验证，另外再将带有AD-文库蛋白的AH109酵母克隆与带有BD-bait蛋白的Y187酵母克隆进行杂交，验证阳性克隆的真实性。

文库cDNA片段的PCR鉴定

—2 000bp

—2 000bp —500bp

—500bp

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2 000bp —500bp

—2 000bp —500bp