125 专家论坛

禽流感病毒的传播、致病机制及其防治

李晓峰　秦鄂德

　　【摘要】　高致病性禽流感病毒(H5N1)可导致严重的致死性疾病,已给全球禽类养殖及相关产业造成了

巨大损失,并对人类健康造成了极大威胁。近30年来,H5N1病毒已在东南亚、中国、欧洲和非洲等地呈区

域性流行。尽管目前还未发生人际传播,但该病毒一旦与人流感病毒重组,将会转变为可人间传播的高致死

性流感病毒,从而导致新的流感大流行。直接接触感染禽流感病毒的禽类或其含病毒的排泄物是人类感染

禽流感病毒的主要途径。禽流感病毒经过不断变异后有可能突破种属屏障而传播给哺乳动物及人类,从而

进一步在病毒和宿主的多种因素作用下导致宿主发病乃至死亡。目前,疫苗接种仍是预防人禽流感的有效

手段,同时神经氨酸酶抑制剂等抗病毒药物在禽流感的治疗中也发挥着重要作用。

　　【关键词】　禽流感;流感病毒A型,H5N1亚型;毒力

　　【中国图书资料分类号】　R51117　　【文献标识码】　A　　【文章编号】　057727402(2009)02201252

06李晓峰博士

Researchprogressonthemechanismoftransmission,pathopoiesis,treatmentandpreventionofavianavirus(H5N1)

LIXiao2feng,QINE2de.StateKeyLaboratoryofandofMicrobiologyandEpidemiology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,,【Abstract】　Theoutbreakofhigh2pathogenicityavianseverelydisruptedpoultryproductionandtradeandposedasignificantpublic,thevirushasbeenendemicinSoutheastAsia,China,EuropeandAfrica.littlebetweenhumans,aprocessofgeneticreassortmentcouldoccurinavirusahumanstrainofinfluenzaAvirus.SoH5N1representsapotentialsourceofthenextavian2humanH5N1virustransmissionisthepredominantmeansofhumaninfection,throughdirectcontactwithandvirus2contaminatedfomitesorwithfertilizercontainingpoultryfeces.Afterseveralroundsofinfectionthevirusesacquirethemutationsrequiredforcrossingspeciesbarrierandinfectarangeofmammalianspeciesincludinghumans.Currently,vaccinationisstillthekeystrategytopreventsevereillnessanddeathfrompandemicinfluenza.AntiviraldrugssuchasNAinhibitorsplayanimportantroleinantiviraltreatment.Thefeaturesofavianinfluenzavirusanditsmechanismoftransmissioninanimalsandhumansareherewithreviewed,andthepathopoiesisofthevirus,thecurrentstatusofvaccinedevelopmentandantiviraltreatmentarealsodiscussed.　　【Keywords】　influenzainbirds;influenzaAvirus,H5N1subtype;virulence

禽流感是由甲型流感病毒引起的一种常见禽类传染病,可分为低致病性禽流感(lowpathogenicavianinfluen2za,LPAI)和高致病性禽流感(highlypathogenicavianinfluenza,HPAI)。低致病性禽流感病毒病原体从禽类等储存宿主传播给鸡鸭等易感家禽后,再经若干次循环感染,就可能发生一系列突变而转变为具有严重致死性的高致病性禽流感病毒。根据禽流感病毒血凝素H和神经氨酸酶N的特征,可将其病原体分为多个不同亚型,其中可直接感染人的为H5、H7、H9和H10四个亚型。1997年我国香港地区报告了全球第一例经H5N1病毒感染致死的人类病例[1]。此后,在东南亚、中国、欧洲、非洲和中东地区不断有包括人在内的哺乳动物感染和死亡的报道,表明该病毒已经突破了种属屏障。其中,越南和印尼的感染人数和死亡率最高,死亡率分别为45%和78%[2]。

目前,H5N1已在亚洲和全球一些地区呈区域性流行。由于该病毒感染家禽后有时并无明显发病特征,增加了对其禽类感染源控制的难度。尤其令人担心的是,当人类发生高致病性禽流感与人流感共感染后,人体内的禽流感和人流感病毒就有可能发生重组,产生一种人间高效传播的致死性高致病性流感病毒,1918年暴发的“西班牙流感”的恐怖情形将可能重现。尽管迄今还未有禽流感在人与人之间传播的报道,但不断发生的人类感染也增加了人流感与禽流感病毒重组的几率,H5N1全球大流行的危险性显著增加。鉴于此,人们对H5N1引发的HPAI的传播机制、致病机制及防治手段进行了大量研究,并取得了一系列成果。

1　禽流感病毒的生物学特征

流感病毒属正黏病毒科,是一种呈球形或杆状、有包膜的单股负链RNA病毒,其基因组分为8个节段,编码血

【作者简介】　李晓峰,理学博士。主要从事烈性传染性病毒相关的病原学及其防治研究

【作者单位】　100071　北京　军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室(李晓峰、秦鄂德)

126 凝素(hemagglutinin,HA),神经酰胺酶(neuraminidase,NA),基质蛋白(matrixprtein,M)M1和M2,非结构(non2structrual,NS)蛋白NS1和NS2,核蛋白(nucleocapsid)以及三个聚合酶PB1、PB2(polymerasebasic1,2)和PA(pol2ymeraseacidic)等10种蛋白。根据核蛋白和基质蛋白的抗原性不同,流感病毒被分为甲型、乙型和丙型,禽流感病毒属于甲型流感病毒。甲型和乙型流感病毒的主要抗原表位位于跨膜糖蛋白HA和NA,根据这些糖蛋白抗原性的差异,甲型流感病毒可分为16个H亚型(H1-H16)和9个N亚型(N1-N9),其中引发HPAI的病毒均属H5和H7亚型。

HA是嵌合于病毒包膜内并被糖基化和酰基化的蛋白,其位于包膜外侧的呈刺突状的球形头部与细胞受体的结合有关。NA也是跨膜糖蛋白,具有唾液酸酶活性,并在病毒出膜时释放位于细胞表面的子代病毒。该功能不仅可以避免释放过程中病毒的聚集,还可能有助于病毒穿透上皮组织的黏膜层以完成对细胞的吸附[3]。甲型流感病毒通过成熟的HA糖蛋白三聚体附着于细胞表面,该过程是通过识别细胞受体末端不同类型的唾液酸(N2乙酰基或N2羟乙酰基神经氨酸)、次末端与半乳糖连接的不同的糖苷键以及细胞表面唾液酸寡聚糖内部区段的组分来完成的。病毒在与适当受体结合后,就以依赖和非依赖网格蛋白的机制包被于内涵体中,并通过自身与内涵体2溶酶体膜的融合来避免被降解。之后,核衣壳蛋白中的8个基因组RNA节段被释放到胞质中,并进一步被转运到核内,完成病毒mRNA的转录和病毒基因组RNA的复制。病毒蛋白的翻译以及核衣壳蛋白组装完成后,子代病毒便以出芽的方式从已插入病毒糖蛋白的细胞膜中释放。

由于病毒编码的RNA依赖的RNA聚合酶校正能力较低,流感病毒极易发生突变,达5×10-5。物等,那么HA和NA糖蛋白的抗原决定簇将会发生突变,病毒准种中的优势毒株,这个过程称为抗原漂移(感病毒亚型后,,将会产生携带有不同亲代病毒遗,,(antigenicshift)。1957年(H2N2)和1968年(H3N2)2　211　禽类之间的传播　低致病性禽流感病毒一般在野生水鸟中形成稳定的循环。除宿主间的直接传播外,通过含有病毒的水体和污染物的间接传播也是病毒传播的一条重要途径。与哺乳动物(人、猪和马)中流感病毒的感染不同,后者主要以气溶胶的方式传播。在鸟类排泄物中,病毒滴度最高可达每克粪便含10817鸡胚半数感染剂量(EID50)的病毒[4]。在自然环境中,悬浮于水中的病毒在17℃时传染性能保持100d以上,而在-50℃以下则可无限期保存。Okazaki等[5]提供的数据表明,古北区(包括欧洲、阿拉伯北部以及非洲的撒哈拉以北部分)的禽流感病毒在冬天无自然宿主迁移的情况下仍能够在结冰的湖水中存活。当禽类在春天返回繁殖后代时,这些禽类及其后代(易感)就会被水中偶尔释放出的病毒再次感染。当家禽与野生禽类共用水源,或者食用已被感染的野生禽类污染的水或食物,病毒就极有可能由野生禽类传播给家禽[5]。家禽一旦受到感染,就会分泌足量的高致病性禽流感病毒,以确保其在一种家禽内及不同家禽间的持久传播。此外,出售的活禽若处在拥挤的情况下,病毒传播的机会也会大大增加[6]。在H5N1亚型高致病性禽流感病毒出现之前,高致病性禽流感病毒不大可能会由家禽再次传染野生禽类。然而在2005年4月,中国西北地区的青海湖出现了H5N1引发的高致病性禽流感,致使数千只斑头雁及其他迁徙的鸭类、鸬鹚和海鸥发生感染[728]。因此,由野生禽类介导的H5N1病毒的传播应当引起足够的重视。212　向其他哺乳动物的传播　在适宜的情况下,禽流感病毒可传播给不同种类的哺乳动物,经几轮复制和适应性改变后就可成为新的流行毒株。欧洲猪群中主要流行的是类似禽流感H1N1的病毒。一种人2禽重排病毒H1N2于1992年在英国首次被分离到,而且该病毒的流行区域不断扩大。在美国流行的则是由H1N1、人类的H3N2和禽类的亚型病毒重新组合形成的三联重排病毒(H3N2)。在猪群体内还发现其他可能来源于禽类的亚型病毒如H1N7、H4N6等,如2003年在中国东部的猪群中流行的是禽源H9N2病毒[9]。除猪以外,在海洋哺乳动物和马的体内也发现过禽源的甲型流感病毒。在泰国一家动物园内的老虎及其他大型猫科动物因食用含有病毒的死鸡后感染了H5N1,随后这些动物出现了严重的病症并大量死亡。该家动物园还发现病毒可在猫科动物间传播,这是首次有关H5N1病毒感染猫科动物的报道[10]。2004年对越南3000份户外散养的猪血清标本进行检测,结果表明只有0125%的样品血清学阳性[11]。该研究还发现,在亚洲人和禽类体内分离的H5N1可感染猪群,但在实验条件下该病毒并不会在猪群之间传播,这表明H5N1病毒在自然状况下就能可感染猪群,而猪群在H5N1病毒的流行中并未发挥重要作用。

127 213　向人类的传播　病毒的H和N糖蛋白针对某一宿主的特异受体类型而产生的适应性改变对于病毒的有效复制至关重要,这意味着病毒经种间传播后,HA蛋白的受体结合部位会发生形态变化。不同流感病毒感染的宿主特定组织可表达多种唾液酸寡聚糖,禽流感病毒普遍对α22,3连接的唾液酸(SA)亲和力最高,这是因为该型SA是易感宿主内源性上皮组织(肠道和肝脏)的主要受体。与此相反,人流感病毒主要对人呼吸道无纤毛上皮细胞上以α22,6方式连接的SA有较高的亲和力。这种受体的偏好性也属于种间屏障的范畴,该屏障可阻止禽流感病毒以非经口方式传播给人。然而最近Matrosovich等[12]的研究发现,在人气管中存在有纤毛的上皮细胞,该细胞具有密度较低的与禽流感受体类似的糖配体,而鸡的细胞中也存在低密度的人源性唾液酸受体,这也解释了为什么人类仍有感染某种禽流感病毒的可能。

1997年在香港首次发现H5N1可诱发人类产生呼吸道疾病,当时18例感染者中有6例死亡。2003年香港地区又发生了2例H5N1感染人的病例[13],进一步对该病毒的序列进行分析发现,HA中的第227位氨基酸发生了突变,致使其能同时结合禽类的SAα22,3和人类的SAα22,6型受体。从流行病学的角度看,这些病例与活禽市场暴发的高致病性H5N1病毒有关[14]。与感染的活禽或被其粪便严重污染的物体和水面有密切接触的人,感染H5N1病毒的危险性最大。在禽类尸体中的所有组织(包括禽肉)中均可发现H5N1,因此在禽类的屠宰、拔毛及烹饪过程中也有接触病毒的危险。目前还没有证据表明经过正确烹饪的禽肉或禽产品是人类感染H5N1的来源。

在已有的人感染H5N1病例中,有相当多的患者源自同一家庭,这些患者的共感染是由所处的环境相同所致,还是发生了人际传播,目前证据还不充分。此外,40岁以上的人感染H5N1楚。关于人类遗传因素所导致的个体不同的易感性,3　高致病性禽流感病毒的致病机制

,复制效率、H5和H7亚型引起的,,病毒传入易感家禽后,经过数轮循环感染会突变为高致病性形式。

甲型流感病毒的HA0前体被宿主蛋白酶水解后可形成以二硫键相连的HA122二聚体,HA2亚基的N末端有一个融合肽,在病毒包膜与溶酶体膜的融合过程中发挥着重要作用。因此,HA0前体的水解是病毒增殖的关键步骤。研究表明,高致病性禽流感病毒的HA0中连接HA1和HA2间的碱性多肽可被广泛分布于全身组织的蛋白酶(如弗林蛋白酶和前体蛋白转化酶)水解,因此该病毒也可在除呼吸道和胃肠道外的其他部位复制,进而引发全身性的病理反应[15]。但H5N1病毒的组织嗜性在不同种类的动物中也存在差异,如荧光标记的H5N1与人、雪貂、猫科动物及猕猴的肺泡上皮细胞的结合能力要强于气管上皮细胞,但在小鼠中则与后者的结合能力更强,这也表明H5N1对小鼠和人类的致病机制可能在某些方面存在显著差异。有些病毒株编码HA切割位点的核苷酸序列及其应有的表型和致病性与预测的并不一致。智利一株以节段间重组方式产生的H7N3亚型高致病性禽流感病毒,仅在-1、-4和-6位是碱性氨基酸残基[16],而从得克萨斯州分离到的H5N2亚型病毒虽存在与高致病性禽流感病毒一致的切割位点序列,但在临床上则归为低致病性禽流感病毒[17]。

禽流感病毒编码的聚合酶PB2可能与其毒力相关。研究发现,在BALB/C小鼠模型中,其病毒毒力及传播能力与PB2的Lys627和Asn701密切相关[18]。从越南和荷兰的H5N1感染死亡患者体内分离的病毒的PB2也含有Lys627[19220]。由于大部分禽流感病毒PB2含有Glu627,推测Glu’Lys可能是病毒感染哺乳动物后发生的适应性突变。最近的研究表明,病毒毒力还与另外两个聚合酶PB1和PA有关[21222]。另有许多被认为与病毒致病性相关的遗传标记定位于H5N1亚型病毒Z基因型的不同区段。利用反向遗传学技术进行的研究表明,一些H5N1亚型病毒的第92位含有谷氨酸的NS1蛋白可以阻碍干扰素及肿瘤坏死因子α发挥抗病毒作用,从而增强病毒在感染宿主体内的复制并降低宿主对病毒的清除速率[23224]。此外,NS1蛋白还可介导宿主细胞因子网络的破坏,由此引发的变态反应可导致肝损伤。

同其他病毒一样,人感染H5N1后,呼吸道黏膜的上皮细胞和免疫细胞迅速产生细胞因子,并激活免疫细胞,进而导致局部和全身效应。感染H5N1的患者体内的巨噬细胞趋化因子CXCL10、CXCL9、CCL22和IL28的水平

γ的水平也显著升高。研究发现,要明显高于人流感病毒感染患者。此外,H5N1感染者体内IL210、IL26和IFN2

β,而在体内则诱导巨噬细胞产生多种细胞因H5N1可在体外诱导原代肺细胞产生IL28、IL26、CCL2、CCL5和IFN2

α,IFN2αβ子,包括TNF2、,CCL22、3、4、5等[25226],表明病毒在体内可诱导产生细胞因子级联效应。因此,细胞因子的

显著升高可能是病毒致病的诱因而非患者发病的结果。

128 总之,H5N1的致病机制可能涉及多种因素,如病毒组织嗜性、复制水平和在不同细胞中病毒基因的表达以及传播能力等。一些治疗手段可能只针对其中的某方面发挥作用,而对病毒诱导细胞反应的机制进行深入研究则有助于通过特异性的免疫调节机制对该病进行治疗。

4　禽流感疫苗

如同人类流感一样,禽流感抗原表位所在的血凝素HA也在不断发生变异。同时,禽流感病毒拥有16个HA亚型和9个NA亚型,可组合为144个不同亚型的病毒,但目前还无法确定哪个亚型的病毒具有大流行的潜能。因此,研制一种针对流感大流行的禽流感疫苗十分困难,H5N1病毒疫苗尤为如此。一方面,对于新的流感病毒,一般需进行两次以上免疫才可能起到预防作用;另一方面,用于生产疫苗的鸡胚感染高致病性禽流感后,还未产生足够滴度的病毒便已死亡,因此获得足够剂量的高致病性禽流感疫苗困难重重。此外,目前全球每年可生产3亿单位的疫苗,仅能满足415亿人进行两次疫苗接种,而这一产能对于可能暴发的全球大流行的流感而言只是杯水车薪。尽管如此,世界各国科学家仍在不遗余力地进行高致病性禽流感疫苗的研制。

为了解决高致病性禽流感疫苗研制中的安全问题,目前采取的策略是以低致病性禽流感病毒作为疫苗候选株,或将高致病性禽流感病毒HA中的切割位点进行替换来改变其结合特性,从而改变其侵染能力。传统亚单位疫苗的交叉保护作用较弱,因此选择与可能暴发的流感大流行匹配的疫苗候选株至关重要。为此,WHO已确定将隶属进化分支1(clade)的A/Vietnam/1203/04株,分支211的A/Indonesia/5/05株,分支2A/Bar2HeadedGoose/Qinghai/1A/05株和分支213的A/Anhui//1/05的进化分支1

的疫苗研制已经完成I期临床实验,结果表明,,但对于现有生产技术而言,,H5N1疫苗在两

μg[27],Desheva等[28]以一株经过次剂量共10

H5,该病毒免疫小鼠后可对后I期临床实验。

DNA,如基于腺病毒载体的H5亚型疫苗可对多种不同亚型的H5N1病毒产生交叉免疫保护。我国科学家研制的基于家蚕杆状病毒载体的H5亚型疫苗也具有较好的免疫原性和安全性[30]。此外,将病毒核蛋白和其他病毒蛋白作为免疫原的DNA疫苗的研制也在进行当中,但从目前的研究结果来看,将其作为疫苗候选株还为时尚早。此外,减毒活疫苗因其良好和持久的免疫原性也备受青睐。采用反向遗传学技术可获得与原型病毒生物学特性相近的恢复病毒,进一步引入特定突变后即可获得具有减毒特征的活疫苗。有研究通过改造HA内部的蛋白酶切割序列,以及将NS1蛋白进行不同长度的缺失后获得了多株H5N1减毒株,结果显示,该减毒株具有良好的免疫原性并能对不同亚型的H5N1病毒提供很好的保护[31]。理想的流感疫苗应能对所有亚型流感病毒起到保护作用,而这种通用型流感疫苗的靶标一般为病毒编码的进化保守的蛋白。以M2和NA蛋白为靶标的研究显示,二者对不同亚型的病毒具有交叉保护作用[32233]。

综上所述,笔者认为,未来的禽流感疫苗研究一方面应着眼于建立一个针对不同亚型的疫苗库,并对其免疫原性和保护作用进行有效评价,另一方面则要加快禽流感病毒致病及传播机制的研究。只有深入了解禽流感的生物学特征,才能为疫苗研制奠定坚实的理论基础。

5　抗病毒治疗

在目前可用的四种抗流感病毒药物中,只有神经氨酸酶抑制剂(奥赛米韦)和M2离子通道抑制剂(金刚烷胺)对甲型流感病毒有效[34]。对H5N1病毒引发的感染,奥赛米韦仍是首选用药。不同H5N1流行株对药物的敏感性存在差异,如分支1的病毒和大部分源自印尼的分支2病毒对M2离子通道抑制剂均有抗性,但是源于欧洲和非洲的分支2病毒却对该药敏感。

对H5N1病毒引发的感染的早期治疗对治疗效果有决定性作用,若在发病后12h服用神经氨酸酶抑制剂,其治疗效果与发病后48h开始用药相比,病程可缩短3d。发热持续时间、病症的严重程度、恢复到机体正常状态的时间均与抗病毒治疗的起始时间有关。

在对H5N1病毒感染的治疗过程中还可能出现耐药性毒株,如在小鼠模型中,分离自未经用药的患者体内的H5N1病毒对奥赛米韦和扎那米韦均敏感,但是对于新近分离的H5N1病毒而言,只有加大用药剂量和延长用药时间才能起到抗病毒作用。McKimm2Breschkin等[35]的研究表明,在体外NA突变体E119V、R292K和R152K与奥赛米韦的抗药性有关,其中的一些突变体可导致神经氨酸酶功能缺失,但不会对人体产生很强的致病性。然而

129 最近的一项报道指出,H274Y突变的H5N1突变株在2个患者体内产生了病毒血症,并致其死亡[36]。临床研究还发现,成人用药产生耐药株的几率要低于儿童,这可能是由于儿童从未接种疫苗,其体内存在的大量病毒更容易发生突变。避免产生耐药性的方法是尽可能保证足够的静脉注射药量,或者采取联合用药的方式。目前,Ilyushina等[37]已经对金刚烷联合其他NA抑制剂的治疗方式对减少耐药性毒株的作用进行了评价。

流感病毒的NA可分为两个亚组,第一组包括N1亚型。目前对流感病毒的NA结构进行了深入研究,并明确了各亚型NA中酶作用位点的特征,这也为新型抗病毒药物的设计奠定了理论基础。此外,流感病毒的聚合酶也可作为抗病毒药物设计的靶标。考虑到细胞因子在病毒致病过程中的重要作用,相应的免疫调节治疗也是一种有效的治疗手段。

6　展　　望

导致世界性流感大流行必须同时满足以下三个条件:一种在人群未曾见过的流感病毒HA亚型出现(或再次出现)至少有一代,这种病毒能够感染人并在人体内有效复制,以及易于在人与人之间传播和维持[38]。这表明,新的人流感大流行的威胁不是仅与H5N1的出现相关。迄今,H5N1只满足了上述两个条件,即对大多数人来说,这是一种新的流感病毒亚型,并且它已经感染了人。在至今感染的140多人中已引起严重疾病并显现出高致死率,其中大多数人并未产生针对H5N1样病毒的免疫保护作用。但H5N1病毒如果与已适应人类的病毒发生重组而获得上述特性,那么新的流感大流行则会暴发。,也与人暴露于病毒的危险程度相关。因此,从源头进行H5N1如同另一观点所说:在保护人类免于感染H5N1病毒的过程中,于根除家禽中的H5N1病毒,自1997年从人类中分离到,,宿主范围也已逐步扩大。此外,,现在不仅在亚洲家禽中广泛流行,而且已传染给其中H9亚型病毒,,可以直接感染人类。引起香港人感染的H9N2病毒甚至与1997年的H5N1亚型病毒基因型有亲缘关系。因此,在关注H5N1同时,也不能忽略其他可能的,甚至具有造成更大规模流行潜能的流感病毒,尤其是在贮存宿主中流行的低致病性H5和H7。东南亚家禽中流行的H5N1病毒常引起迁徙鸟类感染,表明高致病性禽流感已向迁徙的野生水鸟传播,这将对全球的家禽养殖业产生严重威胁。只有采取严格的生物安全措施,以及给家禽进行大规模的疫苗接种才能消除这种威胁。此外,病毒在野生禽类中的流行可能导致环境中(湖泊、海岸等)出现H5N1病毒,这也会增加人类暴露于病毒的危险。然而庆幸的是,目前为止还没有野生禽类或环境中的病毒向人类传播的报道。

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(2009201216收稿　2009201221修回)

(责任编辑　李恩江　熊晓然)