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重庆医学 2 0 0 9年 7月第 3 8卷第 1 3期

论

著

真核表达质粒 p c D NA3 . 1 (+)一 r mC Gl￣的构建和鉴定许铁峰。,汪良。,夏立平，陈兴。,阎瑾琦。,于继云。

( 1 .海南医学院肿瘤研究所附属医院肿瘤外科，海口5 7 0 1 0 2; 2 .苏州大学附属第一医院普通外科 2 3 5 3 0 0; 3 .军事医学科学院基础医学研究所疫苗工程研究室，北京 1 0 0 8 5 0 )摘要：目的构建恒河猴绒毛膜促性腺激素 p亚基 ( m a c a c a mu l a t t a c h o r i o n i c g o n a d o t r o p h i n p s u b u n i t, r mC G i￣ )基因真核表达质粒 p c D NA3 . 1 (+)一 r mC Gl 3,并了解该质粒能否在真核细胞中表达。方法通过 P C R扩增 r mC G￣的全段基因 c D NA,应用基

因工程技术将扩增的 c DNA克隆至 P GM— T e a s y,测序后插入 p c DN A3 . 1 (+)真核表达质粒，构建重组真核表达质粒 p c DNA 3 . 1(+)一 r mC Gl 3,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后，用脂质体转染技术转染 B 1 6细胞，通过 RT— P C R扩增出 B 1 6/ p c D NA3 . 1(+)一 r mC Gl 3细胞株中 r mC G l 3全段基因 c DN A。结果经 4轮 P C R,成功扩增出 r mC G￣ 3的 c D NA全长基因，酶切和测序证明正

确构建了真核表达质粒 p c D NA3 . 1 (+)一 r mC Gl 3,通过 R T— P C R方法证实该质粒能在 B 1 6真核细胞中正确表达。建立了稳定的细胞株 B 1 6/ p c D NA 3 . 1 (+)一 r mC G l 3。结论成功克隆和构建了 r mC G l￣的真核表达质粒栽体 p c DNA 3 . 1 (+)一 r mC Gl 3,为进一步研究 r mC G l 3的新功能和免疫治疗奠定了基础。

关键词：恒河猴绒毛膜促性腺激素 G亚基；质粒；真核表达；肿瘤疫苗中图分类号： R 7 3 0 . 2 1 文献标识码： A 文章编号： 1 6 7卜8 3 4 8 ( 2 0 0 9 ) 1 3— 1 5 8 8— 0 3

C o n s

t r u c t i o n a n d d e t e r mi n a t i o n o f a r e c o mb i n a n t e u k a r y o t i c p l a s mi d p c D N A 3 . 1 (+)一 r mC G[￥XU Ti e— fe n g …, WANG Li a n g, XI A Li~ pi n g, e t a 1 . ( 1 . C a n c e r I n s t i t u t e o f Ha i n a n Me d i c a l C o l l e g e, Aff i l i a t e d Ho s pi t a l o f Ha i n a n Me d i c a l Co l l e g e, Ha i k o u 5 7 0 1 0 2, C hi n a; 2 . Ge n e r a l S u r g e r y De p a r t me n t, Ti t e Fi r s t Af l i a t e d Ho s p i t a l o f Su z h o u Un i v e r s i t y, Su z h o u 2 3 5 3 0 0, Ch i n a;

3 . I n s t i t u t e o fB a s i c Me d i c a l R e s e a r c h V a c c i n e Wo r k s, Ac a d e my o fM i l i t a r y Me d i c a l S c i e n c e s, B e i j i n g 1 0 0 8 5 0, C h i n a ) Ab s t r a c t: O b j e c t i v e T o c o n s t r u c t a n e u k a r y o t i c e x p r e s s i o n p l a s mi d e x p r e s s i n g ma c a c a mu l a t t a c h o r i o n i c g o n a d o t r o p i n h o r mo n e

p s u b u n i t ( r mC G[ 3 )g e n e a n d t e s t wh e t h e r t h e g e n e c o u l d b e e x p r e s s e d i n t h e c e l l B 1 6 i n v i t r o . Me t h o d s Th e f u l l— l e n g t h c D NA o fr mCGl 3 g e n e wa s o b t a i n e d b y P CR. Th e n t h e c DNA wa s i n s e r t e d i n t o t h e e u k a r

y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r p c DNA3 . 1 (+) . Th e r e c o m—

b i n a n t e u k a r y o t i c p l a s mi d p c DNA 3 . 1 (+)一 r mC G l f wa s t r a n s f e c t e d i n t o e u k a r y o t i c c e l l B 1 6 b y L i p o f e c t i n . R T— P C R wa s u s e d t o c e r— t i f y wh e t h e r t h e g e n e wa s c o r r e c t l y e x p r e s s e d i n B 1 6/e D NA3 . 1 (+)一 r mC G￣c e l 1 . R e s u l t s e D NA o f r mC G￣w a s c o r r e c t l y a mp l i— l f e d . T h e r e c o mb i n a n t e u k a r y o t i c e x p r e s s i o n p l a s mi d p c D NA3 . 1 (+)一 r mC G l f wa s s u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t e d, a n d i t c o u l d b e c o r r e c t l ye x p r e s s e d i n t h e B 1 6 c e i l s . C o n c l u s i o n Th i s r e c o mb i n a n t p l a s mi d p c DNA3 . 1 (+)一 r mCGI]wi l l p r o v i d e a b a s i s f o r f u r t h e r s t u d y o n

u n k n o w n f u n c t i o n s o f r mC G￣ . Ke y w o r d s: ma c a c a mu l a t t a c h o r i o n i c g o n a d o t r o p i n h o r m o n e 1 3 s u b u n i t ( r mC G￣ ); p l a s mi d; e u k a r y o t i c e x p r e s s i o n; t u mo r v a c c i n e

人绒毛膜促性腺激素 B亚基 ( h u ma n c h o r i o n i c g o n a d o t r o— p h i n 8 s u b u n i t, h C G￣ )除了在正常的妊娠滋养层细胞中分泌

1 . 1 . 3试剂

与耗材

脂质体( L i p o f e c t a mi n e 2 0 0 0 Re a g e n t )购

自I n v i t r o g e n公司，低熔点琼脂糖和 D E P C购自 S i g ma公司，一

外，在许多恶性肿瘤细胞中也大量分泌，称为异位 h C Gl】]。异位h C G与恶性肿瘤的发生和发展的关系受到人们关注，以异位h C G为靶抗原的肿瘤疫苗也成为肿瘤生物治疗新的研究热点]。但 h C G I 3对人的免疫原性弱，在研究时不易观察结果，

步法 RT - P C R试剂盒、 T a q D NA聚合酶试剂盒、 D NA回收

试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自 Ta Ka R a公司， P GM- T e a s y

载体和 T D NA连接酶试剂盒购自 P r o me g a公司， G - 4 1 8购自G i b c o公司， Nh e I和 E c 0 R V限制性内切酶购自 NE wE N—

本组选用 r mC Gf l全长氨基酸编码序列的 e D NA来构建真核表达质粒 p c DN A3 . 1 (+)一 r mC G t 3,通过 R T - P C R检测出 B 1 6/ p c D NA3 . 1(+)一 r mC G￣细胞株中的该基因，为深入研究 r mC G l的生物学功能和以 r f m C G￣ t为靶点的免疫生物治疗奠定了基础。 1材料与方法 1 . 1材料

GL AND B i o L a b s公司， D ME M培养液、小牛血 …… 此处隐藏：15383字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……