PCR法制备地高辛标记DNA探针斑点杂交检测对虾传

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第 1卷第2 1期 2 00 4年 3月

中国水产科学 J u n lo ih r ce c so ia o r a fF s ey S in e fChn

V11 N . o. l o 2 M ac rh 20 0 4

P R法制备地高辛标记 D A探针斑点杂交检测对虾传染性皮下及造血 C N组织坏死病毒 (H V) I HN杨冰， 黄健，宋晓玲，史成银， 莉，刘刘庆慧(中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛 267 ) 60 1

摘要：用非放射性标记物地高辛 ( I )通过 P R方法制备了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 (H N利 DG, C IH V)D A探 N针，针长度 75b .探 0 p标记产量为 2 g I。通过核酸探针斑点杂交检测方法对此探针特异性及灵敏度进行验证，果 0n/ L x结表明，探针具有较高的灵敏度和较强的特异性，该检测 IH V D A的检出灵敏度为 2 . g可检出 2 . g患病对虾 H N N 4 8P, 66n组织 D A中的 IH V, 204n健康虾组织 D A、 25n健康虾匀浆液， N H N与 5 . g N 2 . g 0 白斑综合症病毒 ( S WSV)D A和肝胰腺 N细小病毒 ( P )D A均不发生交叉反应。本方法可应用于健康亲虾、 HV N苗种的培育和无特定病原 ( P ) S F对虾种群的选育及 I H V流行病学调查， H N并具有较高的应用价值、

关键词：性皮下及造血组织坏死病毒 (H N ) P R探针；点杂交传染 I H V;C;斑中图分类号：9 14￥4 . 1文献标识码： A文章编号： 0— 77 20 )2 09— 4 1 5 83一(04 0— 0 5 0 0

传染性皮下及造血组织坏死病毒 (H N自 I H V)

本研究在已建立的 P R检测方法的基础上， C利

2 0世纪 8 0年代初在美国夏威夷地区养殖对虾中被用非放射性标记物一地高辛 ( I )过 P R方法制 DG通 C发现以来，分布的地理范围迅速扩大，其可感染世备 D A探针， N应用斑点杂交检测法检测传染性皮下界各地养殖对虾，尤其对对虾幼虾的危害最大，严重及造血组织坏死病毒 (H N。该方法的建立将为 I H V)影响养殖业的发展。

世界动物卫生组织 ( I )对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒病的诊断及无 OE,

水生动物健康法典 (三版 )将它列为“向 O E特定病原( P )第 需 I S F对虾选育提供可靠的技术手段。申报的甲壳动物重大疾病”一。随着世界贸易及之地区问流动的不断发展，迫切需要建立一种快速、灵1材料和方法1 1材料 .

敏的病毒检测方法。

原位杂交和 P R检测 I H V具有较高的灵敏 1 1 1对虾样品健康南美白对虾 ( eau 1, C H N .. P nes31 0, 1一

度

a e)病，但其所需仪器设备昂贵，操作复杂繁琐。核 n m i为本实验室提供；虾为引进南美白对虾仔

酸探针斑点杂交检测方法具有既快速又灵敏的特虾活体，长 0 7c共约 3 0尾。体 . m, 0点，在疾病诊断中得到广泛应用。。。C r等利用 1 1 2试剂和材料 1 ar .. 0×地高辛 ( I标记混合 D G)

D A提取试剂盒、性磷酸酶标记的抗地高辛碱商品化的 I H V核酸探针斑点杂交检测试剂盒物、 N H N( hi P o e一 I NV, D a xt s Wio . C S r rb m HH igoi, c ln t T,

( I抗体、高辛 ( I标记检测试剂盒、酸纤 D G)地 DG)硝

糖原 ( l oe )地高辛 ( I标记 D A产 g cgn、 y DG) N U A) S对南美白对虾进行 S F筛选， P同时设立原位杂维素膜、 oh公司，5m o g 1、 2 m￣LM Cz1 0交作对比试验，结果证明该方法是一种快速、敏、量测定标准均购自 R ce灵 可靠的诊断方法。利用非放射性标记物地高辛

xP R缓冲液、/ L T q D A聚合酶购自 Po C 5 U a N r—

ea其他试剂为国产分析纯。引物由本实验 ( I通过 P R方法制备 D A探针对对虾白斑综 m g公司， DG) C N合症病毒的检测已有相关报道。。但用该方法对室设计，上海生工生物工程公司合成。.对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 (H N检测 1 2方法 I H V) 12 1 D A的提取 . . N的应用在国内尚属首次。收稿日期： 0— 9— 3修订日期： o—1— 0 2 3 0 0; 0 2 3 1 2. o

分别取健

康和患病南美白对

基金项目：国家“7’ 93’重点基础研究项目( 19020 )助；岛市科技发展计划项目( 2 2一 j h 7 ) G 99 102资青 0— k— h一 4资助 作者简介：杨通讯作者：黄冰(9 5,,士研究生， 17一)女硕主要从事水产养殖动物疾病学研究 . E—m i aui ul、d s n a: qd@p bcq dc l s i健.E— a: qi pbcq .dC m i ads ul.d s.l l@ i l

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中围水产科学

第 1卷 1

虾鳃丝 2 5 g按 D A提取试剂盒说明提取对 5~ 0 m N虾鳃组织 I A )。 N

L )和 H V D A( P N 1

L, )各样品煮沸变性，冰浴

2n n每样取 l L点于硝酸纤维素膜上，0q烤膜 l, i 8 C

1 22 P R法检测 1 . . C HHN感染样品按史成银 2h6 C V ,5q预杂交 2h加入地高辛 ( I ), D G标记的 I H H—等 C“P R技术检测 I H\方法进行， H N同时设立健 N V探针 ( 0n/ L, 2 g m )杂交过夜，涤，入抗体，洗加显

康虾组织 D A及阴性对照： N1 23 P R法制备地高辛 ( I标记 D A探针 . . C D G) N 10 L反应体系中： 0 xP R缓冲液 l L 2 0 1 C 0 ,5 l L正向引物 ( 0, 1 p ) . L反向引物 ( . 03, L 1

色。2结果

m l/ g 18 L 1高辛 ( I ) n lLM C2 ,0x地 o D G标记混合物 2 1 P R反应产物琼脂糖凝胶电泳分析 . CP R产物琼脂糖凝胶电泳结果见图 1由图中 C, p ) . L模板 ( 9 . g p 2 p,离子水结果可见，C . 03 L, 18 5 p/ . .去 L) L P R制备地高辛 ( I标记 D A探针和 DG) N6 . L混匀后进行一个热启动 9℃ 1 l 5感染 I H V南美白对虾 P R产物为 75b, 8 9t。 x 4 0 nn,5 i H N C 0 p与预设

5 l。加入 5U￣ a N nn i /x T qD A聚合酶 0 5 L按产物片段大小一致。 L ., 以下循环，进行 P R扩增：4 q 1n n 5 C l参数 C 9 C l,7q i nn 7 C l l, l,…… 此处隐藏：11340字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……