生物技术综合实验讲义

首都师大生命科学学院

2005年6月

目 录

第一部分 植物组织培养

1.1植物的组织培养技术………………………………………………………………3

1.2植物细胞的悬浮培养………………………………………………………………8

1.3植物原生质体的培养………………………………………………………………11

1.4叶盘法转基因烟草…………………………………………………………………15

1.5植物原生质体融合与体细胞杂交…………………………………………………17

第二部分 基因克隆和植物基因工程

I DNA的制备和分析 …………………………………………………………………21 1 细菌质粒的制备 …………………………………………………………………22

1.1 .碱裂解法 …………………………………………………………………23

1.2 煮沸法 ………………………………………………………………………24

1.3小量一步提取法 ……………………………………………………………25

1.4 试剂盒法 ……………………………………………………………………25

2 植物DNA的制备 …………………………………………………………………28

2.1 CTAB法提取植物基因组DNA ………………………………………………28

2.2 SDS 法提取植物基因组DNA…………………………………………………29

II RNA的制备和分析…………………………………………………………………32 1 异硫氰酸胍—酚法制备植物总RNA………………………………………………34 2 Trizol法 …………………………………………………………………………36 3 RNA的定量和完整性分析…………………………………………………………37

3.1 甲醛变性电泳检测RNA完整性 ………………………………………………37

3.2 RNA含量和纯度的测定………………………………………………………38 Ⅲ DNA的克隆……………………………………………………………………………40 1 DNA的酶切 …………………………………………………………………………42 2 DNA片段的纯化回收………………………………………………………………44 3 体外重组……………………………………………………………………………46 4 重组DNA的转化和蓝白筛选………………………………………………………48 Ⅳ PCR相关技术 …………………………………………………………………………53 转基因烟草的PCR检测 ………………………………………………………………56 Ⅴ 分子杂交技术…………………………………………………………………………58 1 同位素标记探针的分子杂交 ………………………………………………………61 2 DIG标记探针的分子杂交……………………………………………………………62

第三部分 重组蛋白诱导表达

3.1重组蛋白在E.coli中表达及纯化 ……………………………………………………67

第一部分 植物组织培养

实验一 植物的组织培养技术

一． 实验目的：

1. 学习固体培养基的配制；

2. 掌握胡萝卜愈伤组织的诱导方法。

二． 实验原理：

植物组织培养理论依据是植物细胞具有全能性。

植物组织培养是指用无菌培养的方法，在人工制备的培养基上培养植物体的一个离体器官、离体的一种组织，或单个细胞，这些离体的器官组织，或单个细胞在无菌条件下不断生长，并经过转移，能够一代一代的延续生长下去，它的方法与微生动物培养技术相似，全部在人工控制下进行。

组织培养技术内容是20年来已经从组织培养（组织块培养）发展到细胞培养、原生质体培养和细胞融合培养等等。并用之进行各种生理化及遗传操作研究。

三、实验剂试剂和设备

1．试剂一MS培养基需要量mg/L

NH4NO3 1650mg

KNO3 190mg

KH2PO4 170mg

MgSO4.2H2O 370mg

CaCl2.2H2O 440mg

FeSO4.7H2O 2.79mg

MnSO4.7H2O 8.6mg

H3BO3 6.3mg

KI 0.83mg

NaMoO4.2H2O 0.25mg

CuSO4.5H2O 0.025mg

COCl2.6H2O 0.025mg

甘氨酸 0.2mg

VB1 0.4mg

VB6 0.5mg

烟酸辣 0.5mg

肌醇 100mg

蔗糖 30g/L

琼脂 68g/ml

为了配制培养基方便，通常配制一系列的母液。大量元素可单独或混合配制成使用浓度的10倍，微量元素可混合配制成使用浓度的1000倍，维生素生长调节物质单独配制成使用浓度的1000倍，铁液也单独配成母液，常用的是EDTA螯和铁。

2．MS培养基母液的配制

（1）大量元素母液（10倍）配1000ml

NH4NO3

KNO3

16.5g 19g 1.7g 3.7g 4.4 KH2PO4 MgSO4.2H2O CaCl2.2H2O

CaCl2.2H2O吸湿性强，称取随时盖盖子。以上分别溶解，顺序混合，因Ca易产生沉淀所以最后加入，可加热助溶，定容至1000ml。

（2）微元素母液（1000倍）

KI

415mg 125mg 12.5mg 12.5mg 11.15mg 4.3g 3.1g NaMoO4.2H2O CuSo4.5H2O CoCl2.6H2O MnSO4.7H2O ZnSO4.7H2O H3BO3

最后定容至500ml

（3）Fe 盐母液

FeSO4.7H2O

Fe2-EDTA 2.78g 3.73g

分别溶解后，加势助深，最后定溶至500ml。

（4）有机附加物及维生素

盐酸硫胺素VB1

盐酸哔哆素VB6

烟酸

1mg/ml 0.5mg/ml 0.5mg/ml 2mg/ml 50mg/ml 甘氨酸 肌醇

IAA少量0.1Nna助溶液

NAA少量95%乙醇助溶

2.4-D少量95%乙醇助溶

IBA少量95%乙醇助溶

KT少量INNHCL助溶

BA少量INNHCL助溶 10mg/10ml 10mg/10ml 10mg/10ml 10mg/10ml 10mg/10ml 10mg/10ml

以上均先溶解在小烧杯中，待完全溶解后，用容量瓶定溶至所需的ml数，其中铁液，KT IAA保存在棕色瓶中，所有配好的药品均放入冰箱中保存，以免变质。

MS培养基1升中含有

大量元素母液 100ml

微量元素母液 1ml

Fe液 5ml

肌醇 1ml

烟酸 1ml

BV1 1ml

BV6 1ml

甘氨酸 1ml

蔗糖 30g

琼脂（最后加入） 8g

激素（根据培养对象不同而异）

培养愈伤组织时，培养基中加入2ml IAA

2ml KT

2．设备：

烧杯、搅棒、容量瓶、量筒、移液管、三角瓶、（100ml）、培养皿、超净工作台（或无菌室）、冰箱、天平，高压菌锅、培养室（或培养箱）镊子、手术、手术剪、酒精灯，打孔器、滤纸、牛皮纸、橡皮圈、消毒棉。

三 实验方法：

1．配制培养基的基本操作

1．1根据所配培养基的要求，从各母液只能感取出大量元素、微量元素、铁液、维生素、激素、蔗糖等，置于容量瓶中定容至100ml

1．2．称取琼脂加入400ml置于大烧杯中加热时不断搅拌，十分钟后琼脂溶解，呈透明状即可，放置稍凉。

2．溶解好的琼脂溶液中加入第1项中所取出的各物质及粮溶液100ml，不断搅拌使培养基

3．用PH计或试纸测PH值，用INNaOH或INNCL调至5.8。

4．将配制好的培养基分装于清洗干净，烘干的三角瓶中，培养基高度约1cm左右，琼脂约在40度时才凝固，所以有充足的时间业分装。

5．将分装好的培养基的三角瓶中塞上棉塞，大小要合适，然后包上牛皮纸，用橡皮盘扎紧。牛皮纸上标以记号准备灭菌。

6．培养基的灭菌与保存。

培养基内含有丰富的营养物质，有利于细菌和真菌繁殖，所以培养基配好后要及时灭菌，用高压锅灭菌注意以下几点：

（1） 检查锅内的水量，一般高度到支持锅座水平即可。

（2） 盖好锅盖，拧紧螺旋，然后检查排气阀是事通畅。

（3） 用煤气灶或电炉加热，当气压指针上升至6时，放一次气或打开放气阀，加热至锅

内冒出大量热气，以排尽锅内空气。

（4） 高压锅内温度达1200C，0，1Mpa压力时，这时保持高压来菌20分钟，以后切断电

源，是锅内压力自然慢慢下降，也可缓缓打开放气阀放气，使锅内压力接近于0（气

压表指针下降至0），这时完全打开放气阀。

（5） 打开锅盖，取出培养基、灭菌水、培养皿、滤纸等。灭过菌的培养基通常置于100C

下保存，待培养基放置2—3天后，瓶内水吸收干后即可使用。培养基灭菌后不宜久

放，一般不超过一个月，多数情况灭菌后两周内使用完。

3．接种——胡萝卜愈伤组织的培养。

接种，是指经过消素好的材料在无菌的情况下切成小块（外植体）并放入培养基的过程，要在无菌的环境中进行。接种进要求无菌操作，所有接种材料要预选消毒。

3.1提前15分钟将超净工作台打开过滤空气。

3.2双手用肥皂洗净，以70%乙醇棉擦试一遍。

3.3取已洗净的胡萝卜5cm切段，用70%乙醇浸炮30秒。然后无菌水冲净，再2%安替福氏浸炮15秒，无菌水冲洗3——4遍置培养皿中。

3.4在培养皿中用打孔器取下胡萝卜的韧皮部切段，切去两端，将材料切成厚3mm的薄片。

3.5接种，用镊子将材料薄片迅速接入培养基中，在酒精灯上移动着烧一下瓶口，塞上棉花塞。

3.6培养，接好种的培养基，放置温度２３——２８０Ｃ光照１０００——５０００ＬuX，光照时间每天约１６——１８小时的培养室中进行培养。随着培养组织的不断生长和细胞分裂，不久即形成愈伤组织并开始

4．植株诱导和转载

除一些基尖，侧牙球茎之类的材料能直接培养长大志植物外，叶，茎段，花瓣等要经过一个脱分化和再分化的过程，才能长成植株。

由于加入培养基中各种激素的比例不同，外植本可以沿着不同方向分化；一种是先由外植本产生愈伤组织，有愈伤组织再分化出不字根或不定芽，也可以由愈伤组织产生胚状体，再发育成小植株：另一种是不经愈伤组织，可直接诱导出胚状全而发育成植物。

不同来源的外植体再生植株的途径

象胡萝卜肉质根诱导产生了愈伤组织之后，需进一步转移至分化培养基诱导产生根和芽，以获得再生植株。

生长点、侧芽、原球茎、胚状体根、茎段、叶、花芽、花瓣、胚状体愈伤组织；再分化的芽和根；试管苗。

四、思考题

1．除了高压灭菌外，还有哪些灭菌方式？

2．无菌操作时，应注意的事项有哪些？

实验二 植物细胞的悬浮培养

将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养其中进行培养和生长的一种技术，称为植物细胞悬浮培养。它是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的一种新的培养技术。从50年代起，米尔（Muir）等便对单细胞培养进行了探讨和研究，得到了万寿菊，烟草单细胞和细胞团的悬浮液。1958年斯图尔德（F.C.Steward）等进行了胡萝卜愈伤组织的悬浮培养，并得到了完整的再生植株。

三十多年来，从试管的悬浮培养发展到大空量的发酵罐培养，从不连续培养发展到半连续和连续培养。80年代以来，作为生物技术中的一个组成部分，正在发展成为一门新兴的产业体系。悬浮培养技术为研究植物细胞的生理、生化、遗传和分化的机理提供实验材料，也为利用植物细胞进行次和代谢物的工业生产提供技术基础。此外，还在育种、快速繁殖、原生质体培养，体细胞杂交以及作为基因转化的受体等方面均得到了广泛地应用。

由于植物细胞具有聚集在一起的特性，因此，在分裂后，往往不能像细菌细胞那样各自分开，而是大多以细胞团的形式存在，至今还不能培养完全是单细胞的县浮液。要进行单细胞培养或选择细胞无性纱，需要进行平板培养，微室培养和看护培养。本实验仅介绍最常用的县浮培养技术。

一、实验目的：

1． 掌握植物悬浮细胞系建立的方法，原理。

2． 学会对悬浮细胞培养物进行细胞计数及绘制细胞生长曲线。

二、实验原理：

植物离体培养可产生愈伤组织。将疏松型的愈伤组织县浮在液体培养基中并在振荡条件下培养一段时间后，可形成分散县浮培养物。良好的县浮培养物应具备以下特征：（1）主要有单细胞和小细胞团组成；（2）细胞具有量盛的生长和分裂能力，增殖速度快；（3）大多数细胞在形态上应具有分生细胞的特征，它们多呈等径形，核一质比率大，胞质浓厚，无液胞化程度较低。要建成这样的县浮培养体系，首先需要有良好的起始培养物——迅速增殖的疏松型愈组织。然后经过培养基成分和培养条件的选择，并经多次断代培养才能达到。县浮培养细胞经长期继代培养后，染色体常有变异现象，细胞的再生能力也有逐渐降低的趋势，然而对于以上生产有用代谢特质为目的的大量培养，这种再生能力的降低不一定有不良影响。

二、实验器材与材料

1．器材

超净工作台、高压灭菌锅、旋转式摇床、水浴锅、倒置显微镜、镊子、酒精灯、100mL三角瓶、移液管，PH计，恒温培养室，漏斗，不锈钢网或筛，血细胞计算板等。

2．材料

松软的烟草或胡萝卜愈伤组织。

3．试剂

（1）附加2%蔗糖，1%甘露醇，500mg/L水解乳蛋白，1。5ml/L，2，4-D的MS培养基，PH调到5.6~6.2。

（2）8%三氧化铬（CrO3）。

三、实验方法

1． 用镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入三角瓶中并轻轻夹碎。每100ml三角瓶含

灭过菌MS培养基10~15ml，每瓶接种1~1.5g愈伤组织，以保证最初培养物中有足够量的细胞。

2． 将已接种的三角置于旋转式摇床上。在100r/min，25~28C条件下，进行振荡培养。

3． 经6~10天培养后，若细胞明显增殖，可向培养瓶中加新鲜培养基10ml，必要时，可用

大口移液管将培养物分装成两瓶，继续培养。（若细胞无明显增殖，可能是起始材料不适当，应考虑用旺盛增殖期的愈伤组织重新接种）。可进行第一次继代培养。

4． 县浮培养物的过滤：按“3”法继代培养几代后，培养液中应主要由单细胞和小细胞团

（不多于20个细胞）组成。若仍含有效大的细胞团，可用适当孔径的金属网筛过滤，再将过滤后的县浮细胞继续培养。

5． 细胞计算。取一定体积的细胞县液，加入2倍体积的8%的三氧化铬（CrO3），置70C水

浴处理15min。冷却后，用移液管重复吹打细胞悬液，以使细胞充分分散，混匀后，取一滴县液置入血细胞计数板上计数。

6． 制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：

（1）鲜重法（fresh weigh method）

在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮细胞培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。

（2）干重法（dry weigh method ）

可在称量鲜重之后，将细胞进行曲烘干，再称量干重。以干重为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞干重生长曲线。

上述两种方法均需每隔2天取样一次，共取7次，每个样品重复三次，整个实验进行期间不再往培养瓶中换入新鲜培养液。

7． 细胞活力的检查。对于初学者，往往需要检测活细胞的比率。可在培养的不同阶段，吸

取一滴细胞县液，放在载玻片上，滴一滴0。1%的酚藏花红溶液（用培养基配制）染色，在显微镜下观察。几活细胞均不着色，而死细胞则很快被染成红色。也可用0。1%荧光双醋酸酯溶液染色，凡活细胞将在紫外光诱发下显示蓝绝色荧光，有经验的操作者，则可根据细胞形态，胞质环流判别细胞的死活。

8． 细胞再生能力的鉴定： 00

为了解悬浮培养细胞是否仍具有再生能力，可将培养细胞转移到琼脂固化的培养基上，使基再形成愈伤组织，进而在分化培养基上，诱导植株的分化。

四、注意事项：

1． 上述步骤均灭菌操作，培养基、用具、器皿等要高压灭菌后方可使用。

2． 如培养液混浊或呈现乳白色，表明已污染。

3． 每次继代培养时，应在倒置显微镜下观察培养物中各类细胞及其它残余物的情况以有意

识地留下圆细胞，弃去长细胞。

五、学生作业与思考题

1．计算出你所制作的悬浮培养物的密度，并绘出其细胞生长曲线图。

2．如何将植物细胞悬浮系用于细胞分化规律或机理的研究？

3．对你的实验结果进行描述，分析和总结。

参考文献

1. Dixon R·A., Callus and Cell Suspension Cultures. In: Dixon RA(Ed) Paint

Cal Culture’s Practical Approach, Oxford:IRL Press. 1985.15~20

2. Jan. Schripsema eatl., Dissimilation Curves as a Simple Method for the

characterization of Growth of Plant cell Suspension Cultures. Plant Cell.

Tissue and Organ Culture. 1990.22:55~64.

3. Seitz H.U.Seitz U & Alfemann W., Pflanzliche Gewebekultur. Ein Praktikum

Stuttgart, New York: Gustav Fischer Verlag. 1985.21~28

实验三 植物原生质体的培养

一. 实验目的：

通过实验掌握原生质体的获得与培养技术

二. 实验原理：

植物原生质体就是除去了细胞壁的一个为质膜所包围的的裸露细胞，用酶降解法脱去细

胞壁的具有活力的原生质体，其在合适的离体培养条件下具有繁殖，分化，再生成为完整植株的能力。利用原生质体便于开展那些因细胞壁存在而难以进行研究的问题，如质膜的表面特性，细胞壁的形成，细胞器的摄取，体细胞的杂交及作为基因式程研究的良好受体系统，通过导入特定基因，获得转基因植株等等。植物原生质体作为一种研究系统，如同在细胞水平上研究某些问题，比在组织、器官或个体水平上有方便之处。

三、实验材料，试剂和仪器

1．材料

无菌烟草叶片

目前已经从高等植物的根、茎、叶、果实、种子等各种组织和器官分离得到原生质体，叶片、愈伤组织和悬浮细胞是容易取材的常用材料，若利用无菌苗可免去表面灭菌的操作步骤避免因条件不适而产生的材料生长的不良影响。

2．试剂

1）酶混合液

按1g材料加入10ml，酶混合液的比例配制。

配制分两步进行：

（1）将CaC2·2H2O 7mmol/L

NaH2O4·2H2O 0.7mmol/L

MES 3mmol/L

甘露醇 0.5mol/L

用重蒸馏水溶解，调pH5.6，定容至10mL，为酶储备液，灭菌备用。

（2）使用时，再加入纤维素酶 R—10 1%

果胶酶 R—10 0.8%

因酶制剂经过高压灭菌处理后会失活，故先将酶储备液灭菌，待用时再将酶制剂按比例加入

到第一步已灭菌的溶液内。

（3）一般酶制剂都不太纯，配好后要经3500rpm离心5min，弃去其中杂质，吸取上清液备用。（所用离心管、滴管等均应经过高压灭菌）

2）洗液

CaCl2·2H2O 8mmol/L

NaH2PO4·2H2O 2mmol/L

甘露醇 0.5mol/L

3）Kg培养基

大量无素： 微量元素：

KNO3 2500 MnSO4·4H2O 10

NH4NO3 250 ZnSO4·7H2O 2

(NH4)2SO4 134 H3BO4 3

MgSO4·7H2O 250 KI 0.75

CaCl2·2H2O 900 Na2MoO4·5H2O 0.025

CaHPO4·H2O 50 CoCl2·6H2O 0.025

铁液： Na——EDTA 37.2

FeSO4·7H2O 27.8

有机附加物：肌醇 100

盐酸吡哆素 1

盐酸硫胺素 10

烟酸 1

激动素 0.2

萘乙酸 0.1

蔗糖 13700

木糖 250

(pH5.6 单位除注明的以外，其它均为mg/I)

通常我们将大量元素、微量元素和铁盐分别配置成10倍或100倍的母液，低温保存，在配培养基时，按比例吸取。

3．仪器

（1）大型仪器：

高压灭菌锅，超净工作台，离心机（4000rpm/s），倒置显微镜，振荡培养箱

（2）一般实验用品

细菌过滤器，滤膜，小滴管，小烧杯，大小培养皿，刻度离心管，小漏斗注射器10mL，小三角瓶50mL，不锈钢网300目，透气膜

四、实验方法

1．原生质体的分离

（1）将按上述配方配置好的培养基、洗液、需要灭菌的酶混合液及一般实验用品，用纸一一包好，0.1大气压灭菌20min。

（2）在超净台内将无菌烟草叶片从培养瓶内取出，放在培养皿内萎蔫1hr。如直接取室外培养的植物叶片，需进行表面灭菌，70%乙醇浸泡5s，无菌无水冲洗2次，再以2%次氯酸钠浸泡10min，无菌水冲选3~4遍。

（3）在灭过菌的酶混合液中加入纤维素酶、果胶酶，待溶解后放入离心管内，3500rpms离心10min，弃沉淀留上清夜为酶混合液。

（4）在超净台内，用注射器抽取酶混合液，转入细菌过滤器（用无菌镊子夹取0。45um滤膜装入），向下缓缓压夜过滤，收集于小三解瓶中，封透气膜待用。

（5）把萎蔫（或灭菌）的烟草叶片至培养皿中，用小解部镊子撕下表皮及去叶脉，将叶片剪成0。5cm2的小块（不易太小，否则会得到过多地破碎细胞），浸在酶混合液中，封透气膜。黑暗振荡培养，保持27C，酶解12-24hr，振速为50~60rpm/min.

2．原生质体的收集与纯化

（1） 取出装有酶解好材料的三角瓶，重新置于超净台内，将酶解物用小漏斗（加入300

目不锈钢网）过滤，不锈钢网目的大小视分离的原生质体大小而异。过滤液收集于

10mL刻度离心管中，500rpm离心2min，未消化完的细胞团或组织留在下锈钢网上

面。去掉酶液，留沉淀即收集的原生质体。

（2） 用洗液和培养基将酶混合液洗干净，以免在以后培养时残留的酶液会影响原生质体

壁的再生。用lmL洗液加到沉淀中，轻轻摇动，用力不可太大，以免原生质体破裂，500rpm离心2min，弃上清液，留沉淀，并重复1次。再用1mL，培养液将沉淀以轻

打起，500rpm离心2min，弃上清液留沉淀。以上几步离心均在超净台内操作。

3．原生质体的培养

（1）用2mL培养液将沉淀轻轻悬起倒入2个小培养皿内，只需一薄层即可。用封口膜封口，以防污染和培养基中水份散失赞成渗透压提高，对原生质体是一种冲击，以至对其完整性的破坏。

（2）将小培养皿放在一装有湿滤纸的塑料袋中，要求在散射的暗淡光（强光刺激会使原生物质体致死）和湿润环境培养，温度25C。第二天用倒置显微镜观察原生质体生长情况，视野内呈现出很大而圆的原生质体。2~3天后细胞壁再生，可用照相记录每天观察的结果。

（3） 原生质体密度：除在极少数富营养培养基中原生质体可以单个培养，并进一步分裂

外，它其它培养基中培养原生质体必须有一定密度，不然难以分裂。密度参数值是

104~105个/mL，确切的密度应该随材料、培养期其它条件不同而异。

（4） 原生质体再生

具有活力的原生质体在合适的培养条件下，3~6天就可以看见原生质体的第一次分裂，2周左右可见到小细胞团。要不断加入新鲜细胞培养基，加入的时间和容量按实验的情况而异，原则上要在原生质体一次或几次分裂后逐步再加入。

细胞团继续长大成愈伤组织到植株分化的过程与其它组织培养的情况相同。

五、思考题

1．原生质体培养时，两种酶的作用是什么？

2．影响原生质体游离效果的因素有哪些？

实验四 叶盘法转基因烟草

一．实验目的：

学习并了解叶盘法转基因烟草的技术流程。

二. 实验原理：

土壤中的农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能够感染植物的受伤部位。农杆菌中有一种环形的Ti质粒，Ti质粒最重要的两个区域为T-DNA区和毒性区，T-DNA是Ti质粒上唯一能够整合到植物染色体上的序列，而毒性区上一系列则帮助T-DNA区整合到植物的染色体上。 土壤农杆菌转化植物的常用方法是叶盘法。这种转基因方法十分简单，一般是将植物的叶片切成小圆片，用农杆菌感染后共培养2-4天，而后转移到加有选择压的分化培养基上分化出芽，在MS培养基上生根后，再生出完整的植株。

三. 试剂及设备

1.试剂：

MS培养基：配方见“植物的组织培养技术”实验指导

Kan：卡那霉素

Cb：羧苄青霉素

NAA：萘乙酸

6-BA：细胞分裂素

T1培养基：MS培养基

T2培养基：MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.5 mg/L+Kan100 mg/L+Cb500 mg/L

T3培养基：MS培养基+ Kan100 mg/L+Cb500 mg/L

（T2：生长培养基；T3：生根培养基）

2.仪器：

光照培养箱，恒温摇床，超净工作台，接种器械等

四.实验步骤：

1 农杆菌培养

1） 从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到 3 ml YEB 液体培养基中（Str 25 μg/ml、

Rif 50 μg/ml、Kan 80 μg/ml）于恒温摇床上 27℃，180 rpm 摇培过夜至 OD 600 为 0.6-0.8。

2） 摇培过夜的菌液按1%-2%的比例，转入新配置的无抗生素的 YEB 培养基中，在与上述

相同的条件下培养6 h左右，OD600 为 0.2-0.5 时即可用于转化。

或： 将按上述方法培养的 OD 600 为 0.6-0.8 的菌液，转入无菌离心管中，于室温条件下，5000 rpm 离心10 min，去掉上清液，菌体用1/2 MS液体（pH 5.4-5.8）培养基重悬，稀释至OD600 为 0.2 左右，用于转化。

2 侵染

于超净工作台上，将菌液倒入无菌的小培养皿中。取不具 Kan 抗性的烟草无菌苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成 0.5 cm的小块，放入菌液中，浸泡适当时间（一般 5-10 min）。取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。

<注>：同时设未经农杆菌侵染的叶盘作为阴性对照，以下步骤同。

3 共培养

将侵染后的烟草叶片接种在不含任何激素和抗生素的MS基本培养基（T1）上，用封口膜封好培养皿，28℃ 黑暗中培养 2-4 天。

4 选择培养

将黑暗中共培养2-4天的烟草叶片转移到筛选培养基(T2)中，用封口膜封好培养皿，在光照为 2,000-10,000 lux、25-28℃、16/8 hd光暗条件下选择培养。

<注>：叶盘边缘轻压入培养基中，以增加选择压力。

5 生根培养

约2-3周后，待不定芽长到 1 cm 左右时，切下不定芽并转移到生根培养基(T3)上进行生根培养，5-10天后长出不定根。

五．思考题：

1.实验报告中描述共培养,选择培养,生根培养过程中植株的变化情况(可附图),并进行结果分析

2.计算T2,T3培养基中加入的抗生素量

T2培养基: MS含量30mL

6-BA

NAA

Kan

Cb

T3培养基: MS含量50mL

梯度 母液浓度 需加入量 梯度 2.0mg/L 0.5 mg/L 100mg/L 500 mg/L 母液浓度 1mg/mL 1mg/mL 50mg/mL 250mg/mL 需加入量 ? ? ? ? -1 2

Kan 100mg/L 50mg/mL ?

Cb 500 mg/L 250mg/mL ?