转基因植物技术的鉴定

转基因植物技术的鉴定组员：魏翠芳、杨帆、甘小东、孙圆圆、 王翠华、张辉、曹盼、王凯、罗青帮 田晓瑞、马小莉、王亚平、袁源

转基因技术将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组 中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的 可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术 (Transgene technology)。 )

技术路线 目的基因分离 植物表达载体的构建 遗传转化 受体材料的准备 转化组织

炼苗

转化植株筛选

组织脱分化

1.目的基因的分离 目的基因的分离(1)已知基因的获得 )①化学合成法 ②PCR扩增

(2)未知基因的获得 )①构建基因组文库，筛选目的基因 ②构建cDNA文库，筛选目的基因 ③mRNA差异显示技术筛选差异表达基因 ④差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因 ……

2.植物表达载体的构建 植物表达载体的构建④pGEM-T

⑤ ⑥ ⑥

① ②①银杏叶RNA提取 银杏叶RNA提取 ②反转录cDNA 反转录 全长cDNA的克隆 ③chs全长 全长 的克隆 ④TA克隆及测序 克隆及测序

③

⑦

⑤向chs两端引入酶切位点 两端引入酶切位点 ⑥双酶切 ⑦定向克隆 ⑧导入农杆菌

⑧

3.受体材料的准备 细胞的全能性：分化细胞脱分化

再分化

4.遗传转化(1)间接转化法 )间接转化法——农杆菌介导转化法 农杆菌介导转化法 (2)直接转化法 A、 基因枪转化法 B、 电击法 C、花粉管通道法 D、 PEG介导基因转化法

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens),

是一种革兰氏阴性土壤杆菌,

它含有Ti质粒,能诱导被侵 染的植物细胞形成肿瘤, 即诱发冠瘿瘤.Ti质粒(包 括Ri质粒)上有一段转移 DNA,在农杆菌侵染宿主 植物时,这段DNA可以转 移进植物细胞,并稳定地 保留在植物细胞染色体中, 变为植物细胞新增加的一 群基因,最终能通过有性 世代遗传给子代 。

基因枪转化法由美国Cornell大学的 Sanfor (1987)提出,它的主要原理是将包 含目的基因的载体包被在微小的金属微 粒(钨粒或金粒)表面,通过高压驱动力加 速微粒穿透植物细胞壁,导入受体组织细 胞内,然后通过组织培养再生出完整的植 株.微粒上的外源DNA进入细胞后,整合到 染色体上并得到表达,从而实现基因的转 化.。

但进去的DNA片段整合效率 片段整合效率 但进去的 极低，不易获得再生植株， 极低，不易获得再生植株，可能 发生共抑制现象. 发生共抑制现象

电击法的主要原理是 将原生质体在溶液中与 DNA混合,然后利用高压 电脉冲作用,使原生质体 膜的某些部位被击穿而 产生可回复的小孔,外源 DNA可通过小孔进入原 生质体内,而且不影响经 电击处理的原生质体再 生植物的能力. 转化效率较低， 转化效率较低，且仅 限于能由原生

质体再生 出植株的植物。 出植株的植物。

花粉管通道法是利用 开花植物授粉后形成的 花粉管通道,直接将外 源目的基因导入尚不具 备正常细胞壁的卵、合 子或早期胚胎细胞,实 现目的基因转化.

PEG介导基因转化的主要原理是聚乙二醇 (PEG)、多聚-L-鸟核苷酸(pLO)、磷酸钙及高 pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分 子.PEG可促使细胞膜与DNA间接触与粘连, 并通过引起膜表面电荷的紊乱及干扰细胞间 的识别,利于细胞膜间的融合以及外源DNA进 入原生质体.

表1 几种植物转基因方法比较转基因方法DNA间接转化法 农杆菌介导基因 转移

转化的优点

转化的缺点

受体种类，可以在原生质体、 转化双子叶植物为主。大 蛋细胞和细胞团、组织器官 多数单子叶植物和裸子植 或整株等多级水平上进行， 物对农杆菌的侵入不敏感， 方法成熟可靠，简便易行， 限制了该法在禾谷类作物 周期短，转化率高； 中的应用。 转化体常出现“嵌合”现 象，需在严格条件下加以 选择以淘汰未转化细胞

无宿主限制，适用于各种单、 转化效率低，需要专门设 备(电击仪、显微操作仪 (1)基因枪转化法 双子叶植物，操作简单 或基因枪),多数需要原 (2) 电击法 生质体与愈伤组织，周期 (3) PEG介导基 太长(电击法) 因转化法 DNA直接转化法(4)花粉管通道法

5.转化组织 ——农杆菌介导之叶盘转化法带有转化基因的农杆菌活化

共培养 侵染 叶盘 受体植物

诱导成苗