第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 中文说明书

第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit中文说明书 2013-12-07 13:20:16

Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒包装与含量 小瓶/瓶盖 标签 适用于 a) 04 379 012 001 b) 04 896 866 001 c) 04 897 030 001

1

红色

Transcriptor

Reverse

Transcriptase（逆转录酶）

a) 1瓶，25 μl (20 U/μl)

b) 1瓶，50 μl (20 U/μl)

c) 2瓶，各50 μl (20 U/ μl)

储存缓冲液：200 mM 磷酸钾，2 mM 二硫苏糖醇，0.2% Triton X-100(v/v)，50% 甘油(v/v)，pH 约为7.2

2

无色

Transcriptor RT

Reaction Buffer(5×)

（逆转录缓冲液）

a) 1瓶，1 ml

b) 1瓶，1 ml

c) 2瓶，各1 ml

5×浓度：250 mM Tris/HCl，150 mM KCl，40 mM MgCl2，pH约为8.5(25°C)

3

无色

Protector

RNase Inhibitor

（RNase抑制剂）

a) 1瓶，50 μl(40 U/μl)

b) 1瓶，100 μl(40 U/μl)

c) 2瓶，各100 μl(40 U/μl)

储存缓冲液：20 mM Hepes-KOH，50 mM KCl，8 mM 二硫苏糖醇，50 % 甘油(v/v)，pH 约为7.6 (4°C)

4

黄色/

紫色

Deoxynuc-leo-tide

Mix

（dNTP）

a) 1瓶，100 μl(黄色瓶盖)

b) 1瓶，200 μl(紫色瓶盖)

c) 2瓶，各200 μl(紫色瓶盖)

dATP, dCTP, dGTP, dTTP各10 mM

5

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蓝色

Anchored-oligo(dT)18

Primer

（锚定oligo(dT)18引物）

a) 1瓶，100 μl(50 μM)

b) 1瓶，200 μl(50 μM)

c) 2瓶，各200 μl(50 μM)

6

Random Hexamer

a) 1瓶，100 μl(600 μM)

蓝色

Primer（随机引物）

b) 1瓶，200 μl(600 μM)

c) 2瓶，各200 μl(600 μM)

7

绿色

Control RNA

（对照RNA）

a) 1瓶，20 μl(50 ng/μl)

包含提取于永生细胞系(K562)的总RNA片段稳定溶液

8

绿色

Control Primer Mix PBGD

（对照基因引物）

a) 1瓶，40 μl

5 μM 人类PBGD特异性正向与反向引物

9(b和c为瓶7)

无色

Water, PCR-grade

a) 1瓶，1 ml

b) 2瓶，各1 ml

c) 3瓶，各1 ml

注意：货号为04 896 866 001和04 897 030 001的产品不含有control试剂(瓶7和瓶8)，因此瓶7即为Water, PCR-grade。

储存条件及其稳定性

请将该产品存放于-15~-25°C条件中，并于产品标签上的有效期之前使用。 注意：Control RNA(货号04 379 012 001的瓶7)应储存于-70°C条件。 请避免将产品反复冻融！

2 产品使用方法

2.1 实验前准备

样本材料

RNA模板：分离的总RNA，mRNA，病毒RNA或体外转录的RNA。

注意：想要得到较好的RT结果，使用高质量完整的RNA(不含基因组DNA残留、RNA酶、抑制剂)是必要的。请根据以下预防措施进行操作，避免使RNA在分离过程中受到RNA酶的污染(从细胞裂解开始)：

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- 使用RNA酶抑制剂(如Protector RNase Inhibitor)或在使RNA酶失活的分离条件下进行操作。 - 如果有必要，用凝胶电泳分析过程中不同步骤(裂解、分离)以确保样本中不含有RNA酶。 - 请记住RNA酶也可能出现在受到污染的玻璃容器中。

为了准备总RNA或mRNA，我们建议您使用罗氏应用科学部的试剂。为了筛选出能够产生高质量的适用于RT-PCR的完整RNA模板，请参考第3部分。补充信息：想了解订货信息或查看相关核酸分离纯化指南，请访问http:///napure. 想了解关于使用

MagNA Pure LC System或MagNA Pure Compact System进行核酸自动分离的更多信息，请访问http://.

引物

六聚物随机引物

在常规的RT反应中，使用5μg的总RNA模板，可采用60μM的随机引物终浓度。使用5μg总RNA并增加随机引物浓度，将增加短片段PCR产物（ 的产率，但是相应地，长片段PCR产物及全长转录子的产率会降低。在非特异引物的反转录方法中，随机引物法是最多使用的一种方法，其特异性的扩增产物只能通过后续的PCR反应中使用特异的PCR引物获得。

锚定oligo(dT)18引物

锚定oligo(dT)18引物特异性地结合在带有poly(A)+的RNA片段上，这类片段通常只占总RNA的1-2%，因此用锚定oligo(dT)18引物进行反转录所获得的cDNA产率大大低于随机引物方法。如果实验是为了获得新mRNA的RT-PCR产物，则推荐使用锚定oligo(dT)18引物。使用该方法获得的RT-PCR产物具有较强的一致性。

特异性序列引物

使用特异性序列引物，其终浓度推荐为2μM。但是请注意，即使这些引物在以DNA作为模板的PCR反应中成功获得扩增产物，相同的引物序列却可能难以定位在cDNA片段上。如果遇到此类情况，请使用锚定oligo(dT)18引物重新进行第一链合成反应。

2.2 实验流程

标准RT-PCR流程

在此提供两种不同的操作流程：

A：反转录使用锚定oligo(dT)18引物或六聚物随机引物或特异性序列引物。在大多数情况下，只选择其中的一种引物进行cDNA合成。

B：反转录使用oligo(dT)18引物和六聚物随机引物的混合物。这种方法可提高反应敏感度，但与使用单一oligo(dT)18引物比起来反应特异性会降低。

注意：根据您使用的引物类型，参考以下给出的流程A与B。

流程A：使用锚定oligo(dT)18引物或六聚物随机引物或特异性序列引物合成cDNA。

以下描述的条件适用于两步法RT-PCR的第一链cDNA合成。图1为单一反应和多重反应中cDNA合成流程概述。

单一反应

多重反应

RNA+引物+水

可选：变性

10min 65°C

冰上配置多重RT反应混合液(除RNA模板)并分装到各反应管

添加模板RNA到每个反应管中

置于冰上，添加缓冲液，RNase Inhibitor，dNTPs，Transcriptor RT

锚定oligo(dT)18引物/特异性序列引物

30min 55°C或1h 50°C

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六聚物随机引物

10min 25°C

30min 55°C或1h 50°C

85°C失活5min

添加1-5 μl至PCR体系或RT-PCR体系

准备

cDNA合成

图1：单一反应和多重反应中cDNA合成流程概述

①

使用前先将所有冷冻试剂解冻。

开始实验前将所有试剂轻度离心。

实验开始后保持将所有试剂置于冰上。

②

将无菌、无核酸酶、薄管壁的PCR管置于冰上，以20 μl反应体系为例，按照以下组分准备模板-引物混合物。

注意：进行与RNA相关的操作时请保持配戴手套。

模板-引物混合物(1次反应) 成分 体积 最终浓度

总RNA或

poly(A)+ mRNA

1 μg 总RNA或

10 ng poly(A)+ mRNA

引物 - 以下任选其一：

Anchored-oligo(dT)18 Primer, 50 pmol/μl (瓶5)

1 μl

2.5 μM 或Random Hexamer Primer, 600 pmol/μl (瓶6)

2 μl

60 μM

或Sequence-Specific Primer

可变

0.5-2.5 μM

Water, PCR-grade (瓶7或9)

可变

使总体积为13 μl

总体积

13 μl

以上为初实验的建议浓度。为了得到合适的模板浓度，需要使总RNA的量在10 ng到5 μg之间，使mRNA的量在1 ng到100ng之间。

注意：当RNA样本浓度较低(< 10 μg/ml)时，添加10 μg/ml MS2 RNA*以使RNA模板稳定。 ③

可选步骤：

在65°C条件下加热反应管10min使模板-引物混合物变性。此步骤可确保RNA二级结构变性。 立即将反应管置于冰上冷却。

④

在含有模板-引物混合物的反应管中加入下表中其余的RT反应液组分。 成分 体积 最终浓度

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Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer, 5×(瓶2)

4 μl

1×

(8 mM MgCl2)

Protector RNase Inhibitor,

40 U/μl(瓶3)

0.5 μl

20 U

Deoxynucleotide Mix,

每种dNTP各10 mM(瓶4)

2 μl

每种dNTP各1 mM

Transcriptor Reverse Transcriptase,

20 U/μl(瓶1)

0.5 μl

10 U

最终体积

20 μl

⑤

在反应管中将试剂小心混匀。

注意：不要旋涡！

将反应管轻度离心使样本收集于反应管底部。

反应时使用带热盖的加热模块，防止反应管中的液体挥发。

⑥

根据您所使用的引物以及目标mRNA的长度，RT反应孵育时间参考下表：

mRNA的长度 RT反应孵育时间

Anchored-oligo(dT)18 Primer, 50 pmol/μl 或Sequence-Specific Primer

不超过4 kb

55°C下30min

超过4 kb

50°C下60min

Random Hexamer Primer, 600 pmol/μl

不超过4 kb

25°C下10min，

之后55°C下30min

超过4 kb

25°C下10min，

之后50°C下60min

⑦

加热至85°C维持5min使Transcriptor Reverse Transcriptase失活。

将反应管置于冰上以终止反应。

反应管在+2~+8°C下可保存1-2小时，在-15~-25°C下可保存更长时间。

⑧

此cDNA产物无需经过纯化即可用于PCR反应。 使用的引物 目标

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一般来说，使用1-5 μl 第一链cDNA作为模板加入PCR体系中。若是最初的实验，可尝试在50 μl PCR体系中使用2 μl cDNA作为模板。

如果在LightCycler System上进行PCR，在20 μl 的反应体系中使用2-5 μl cDNA或cDNA稀释液。

注意：逆转录反应工作液中MgCl2的最终浓度为8 mM，因此PCR反应混合液中每μl 的 cDNA反应液模板带入了8 nmol MgCl2,根据实际需要优化反应液中的MgCl2浓度。

Transcriptor Reverse Transcriptase具有RNaseH活性。在cDNA合成结束后RNaseH可除去RNA模板，这使得PCR引物更容易与cDNA结合，在某些情况下，这会提高PCR反应的灵敏度。

流程B：使用锚定oligo(dT)18引物和六聚物随机引物合成cDNA。

以下描述的条件适用于两步法RT-PCR的第一链cDNA合成。

①

使用前先将所有冷冻试剂解冻。

开始实验前将所有试剂轻度离心。

实验开始后保持将所有试剂置于冰上。

②

将无菌、无核酸酶、薄管壁的PCR管置于冰上，以20 μl反应体系为例，按照以下组分准备模板-引物混合物。

注意：进行与RNA相关的操作时请保持配戴手套。

模板-引物混合物(1次反应) 成分 体积 最终浓度

总RNA或

poly(A)+ mRNA

1 μg 总RNA或

10 ng poly(A)+ mRNA

Anchored-oligo(dT)18 Primer,

50 pmol/μl (瓶5)

1 μl

2.5 μM 和Random Hexamer Primer,

2 μl

60 μM

600 pmol/μl (瓶6)

Water, PCR-grade (瓶7或9)

可变

使总体积为13 μl

总体积

13 μl

以上为初实验的建议浓度。为了得到合适的模板浓度，需要使总RNA的量在10 ng到5 μg之间，使mRNA的量在1 ng到100ng之间。

注意：当RNA样本浓度较低(< 10 μg/ml)时，添加10 μg/ml MS2 RNA*以使RNA模板稳定。 ③

可选步骤：

在65°C条件下加热反应管10min使模板-引物混合物变性。此步骤可确保RNA二级结构变性。 立即将反应管置于冰上冷却。

④

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在含有模板-引物混合物的试管中加入下表中其余的RT反应液组分： 成分 体积 最终浓度 Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer, 5×(瓶2)

4 μl

1×

(8 mM MgCl2)

Protector RNase Inhibitor,

40 U/μl(瓶3)

0.5 μl

20 U

Deoxynucleotide Mix,

每种dNTP各10 mM (瓶4)

2 μl

每种dNTP各1 mM/

Transcriptor Rerverse Transcriptase,

20 U/μl(瓶1)

0.5 μl

10 U

最终体积

20 μl

⑤

在反应管中将试剂小心混匀。

注意：不要旋涡！

将试管轻度离心使样本收集于反应管底部。

反应时使用带热盖的加热模块，防止反应管中的液体挥发。

⑥

根据您所使用的引物以及目标mRNA的长度，RT反应孵育时间参考下表： 使用的引物 目标mRNA的长度 RT反应孵育时间

Anchored-oligo(dT)18 Primer,

50 pmol/μl 和Random Hexamer Primer,600 pmol/μl

不超过4 kb

25°C下10min，

之后55°C下30min

超过4 kb

25°C下10min，

之后50°C下60min

⑦

加热至85°C维持5min使逆转录酶失活。

将反应管置于冰上以终止反应。

反应管在+2~+8°C下可保存1-2小时，在-15~-25°C下可保存更长时间。

⑧

此cDNA产物无需经过纯化即可加入用于PCR反应。

一般来说，使用1-5 μl 第一链cDNA作为模板加入PCR体系中。若是最初的实验，可尝试在50 μl PCR体系中使用2 μl cDNA作为模板。

如果在LightCycler System上进行PCR，在20 μl 的反应体系中使用2-5 μl cDNA或cDNA

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稀释液。

注意：逆转录反应工作液中MgCl2的最终浓度为8 mM。因此PCR反应混合液中每μl 的 cDNA反应液模板带入了8 nmol MgCl2,根据实际需要优化反应液中的MgCl2浓度。Transcriptor

Reverse Transcriptase具有RNaseH活性。在cDNA合成结束后RNaseH可除去RNA模板，这使得PCR引物更容易与cDNA结合，在某些情况下，这会提高PCR反应的灵敏度。

2.3 对照反应

cDNA合成

目录号为04 379 012 001的产品提供的对照反应包括Control RNA的逆转录，以及后续的在常规热循环仪或LightCycler仪器上进行的扩增检测151bp的PBGD片段的PCR反应。 以下为两步法 RT-PCR对照实验中第一链cDNA合成的条件。

注意：实验开始前应将热循环仪预热至RT反应的温度(步骤4)。

①

使用前先将所有冷冻试剂解冻。

开始实验前将所有试剂轻度离心。

实验开始后保持将所有反应剂置于冰上。

②

将无菌、无核酸酶、薄管壁的PCR管置于冰上，按照以下成分准备含模板-引物混合物的20 μl反应体系。

注意：进行与RNA相关的操作时请保持配戴手套。

模板-引物混合物(1次反应) 成分 体积 最终浓度

Control RNA

2 μl

100 ng

Anchored-oligo(dT)18 Primer,

50 pmol/μl (瓶5)

1 μl

2.5 μM

Water, PCR-grade

10 μl

使总体积为13 μl

总体积

13 μl

③

添加以下成分 成分 体积 最终浓度

Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer, 5×(瓶2)

4 μl

1×

(8 mM MgCl2)

Protector RNase Inhibitor,

40 U/μl(瓶3)

0.5 μl

20 U

Deoxynucleotide Mix,

每种dNTP各10 mM(瓶4)

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每种dNTP各1 mM

Transcriptor Reverse Transcriptase

20 U/μl(瓶1)

0.5 μl

10 U

最终体积

20 μl

吹打混匀。

用微量离心机轻度离心。

④

55°C下孵育30min

⑤

加热至85°C维持5min使逆转录酶失活。

将反应管置于冰上以终止反应。

⑥

反应管在+2~+8°C下可储存1-2小时，在-15~-25°C下可储存更长时间。

PBGD PCR

实验得到的单链cDNA可利用提供的PBGD特异性引物通过聚合酶链式反应进行扩增。这个过程可以利用常规热循环仪或LightCycler仪器完成。

在PCR反应体系为50 μl的常规热循环反应(使用FastStart Taq DNA Polymerase*)中加入5 μl cDNA反应液。

采用LightCycler 1.5 System或LightCycler2.0 System进行的反应总体积为20 μl的real-time PCR (使用LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I*)中加入2 μl cDNA反应液。 采用LightCycler 480 System进行的反应总体积为20 μl的real-time PCR (使用LightCycler 480 SYBR Green I Master*)中加入2 μl cDNA反应液。

想要了解更多PCR或real-time PCR的更多具体信息，请阅读FastStart Taq DNA Polymerase*、LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green*、LightCycler 480 SYBR Green I Master*相关使用说明。

常规热循环仪PCR

根据以下流程准备50 μl标准反应体系。

在做RT对照反应管之余，以水替代cDNA模板加入反应体系作为阴性对照。

①

使用前先将所有冷冻试剂解冻。

开始实验前将所有试剂轻度离心。

实验开始后保持将所有试剂置于冰上。

②

将薄管壁的PCR管置于冰上， 配置50 μl的PCR反应体系,在同一反应管中依次加入下表中各个组分。

成分 体积 最终浓度

含20 mM MgCl2 的FastStart Buffer(10×)

5 μl

1×

PCR Nucleotide Mix*(10 mM)

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0.2 mM

Control Primer MIX PBGD(5 μM)

2 μl

0.2 μM

cDNA from Control RT Reaction

5 μl

FastStart Taq DNA Polymerase*(5 U/μl)

0.4 μl

2 U

Water, PCR-grade

36.6 μl

总体积

50 μl

③

在带有热盖的热循环系统中进行PCR或在反应体系上覆盖30 μl矿物油（如果热循环系统不带热盖）：

1个循环

预变性

94°C

5min

35个循环

变性

退火

94°C

50°C

10s

20s

延长

72°C

30s

1个循环

最终延长

冷却

72°C

4°C

7min

④

取15 μl于3%琼脂糖凝胶上进行电泳。