柑橘原生质体融合及体细胞杂种核质遗传研究

华中农业大学

博士学位论文

柑橘原生质体融合及体细胞杂种核质遗传研究

姓名：徐小勇

申请学位级别：博士

专业：果树学

指导教师：刘继红;邓秀新

20060601

柑橘原生质体融合及体细胞杂种核质遗传研究

摘要

’原生质体融合技术能有效克服柑橘有性杂交不亲和、雌和／或雄性败育以及珠心 胚干扰等问题，实现核ＤＮＡ和胞质ＤＮＡ重组，为柑橘遗传改良提供了一条新的途

径。本研究旨在针对我国一些优良柑橘品种种子多的问题，拟采用“胞质体．原生质体”融合和非对称融合，将温州蜜柑控制雄性不育的胞质因子转入有籽品种中，以获得新的柑橘无核种质。此外，本研究对本实验室以前通过原生质体融合获得的４个组合的体细胞杂种植株进行了核质遗传分析。主要研究结果如下：

１．开展了柑橘胞质体分离的研究，建立了高效的柑橘胞质体分离体系。首先以柑橘胞质雄性不育材料．温州蜜柑国庆１号（Ｃｉｔｒｕｓｕｎｓｈｉｕ）的胚性悬浮系为试材分离原生质体，再通过不连续的甘露醇．蔗糖梯度和超速离心方法分离胞质体；比较了不同的离心速度、离心时间、离心温度、梯度组分的体积和浓度对胞质体分离的影响，结果表明，转速为３８０００ｒ／ｍｉｎ，温度为２５℃，离心２０ｍｉｎ，１５％蔗糖浓度（悬浮原生质体的下层溶液）是分离胞质体最适宜的条件，可获得纯度为９０％的胞质体；胞质体的平均直径为２３．２ｇｍ；使用ＦＤＡ染色，发现胞质体的活力在７５．８５％之间；、采用低熔点琼脂糖包埋培养，４８ｈ后胞质体破裂死亡。

２．开展了柑橘“胞质体．原生质体”融合，获得了国庆ｌ号（Ｃｕｎｓｈｉｕ，ＣＶ．ＧｕｏｑｉｎｇＮｏ．１）＋诺瓦橘柚（ＣｒｅｔｉｃｕｌａｔａＸＣｐａｒａｄｉｓｉ）、国庆１号（Ｃｕｎｓｈｉｕ，ＣＶ，ＧｕｏｑｉｎｇＮｏ．１）＋默科特橘橙（ＣｒｅｔｉｃｕｌａｔａｘＣ．ｓｉｎｅｎｓ＆）２个组合的再生愈伤组织和胚状体。前一组合得到的愈伤组织在诱导胚状体的２％甘油培养基上未见进一步生长和分化；从后一组合，挑出的４４个单个小愈伤培养在２％甘油培养基上，有３个分化出胚状体。对后一组合再生的三个细胞系进行倍性和核质基因组分析，结果表明，再生的细胞系均为二倍体，核ＤＮＡ来自默科特橘橙，而线粒体ＤＮＡ来源于国庆１号。

３．研究了紫外线（ＵＶ）照射柑橘原生质体作为喂养层培养目标原生质体的效果，发现ＵＶ照射的原生质体作饲养层具有促进愈伤原生质体生长的作用，而对叶肉原生质体的生长无促进作用；研究了ＵＶ对柑橘原生质体ＤＮＡ片段化的影响。结果表明，ＵＶ处理后的原生质体比未处理的原生质体发生较高的ＤＮＡ片段化。

４．开展了ＵＶ处理供体的非对称融合研究，获得了国庆５号（Ｃｕｎｓｈｉｕ，ＣＶ．ＧｕｏｑｉｎｇＮｏ．５）＋默科特橘橙（ＣｒｅｔｉｃｕｌａｔａｘＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、国庆１号（Ｃｕｎｓｈｉｕ，ＣＶ．ＧｕｏｑｉｎｇＮｏ．１）＋诺瓦橘柚（Ｃｒｅｔｉｃｕｌａｔａ×Ｃｐａｒａｄｉｓｅ）、国庆ｌ号（Ｃｕｎｓｈｉｕ，ＣＶ．ＧｕｏｑｉｎｇＮｏ．１）＋锦橙（Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）共３个组合的再生愈伤组织和芽。其中前２个组合获得了愈伤组织，后一个组合再生了芽，采用ＦＣＭ、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ和ＣＡＰＳ对再生的四个芽系进行鉴定，结果表明，再生的芽系为二倍体、三倍体或四倍体的体１Ｖ

细胞杂种，其胞质基因主要来源于锦橙（受体），其中２个芽系的叶绿体ＤＮＡ发生了重组。

５．采用ＦＣＭ，ＳＳＲ，ＳＲＡＰ和ＣＡＰＳ对４个融合组合的再生植株的倍性、核和胞质ＤＮＡ来源进行了鉴定。结果表明，在澳洲指橘＋酸橙属间组合中，分析的６棵植株都是二倍体胞质杂种，其核和胞质ＤＮＡ分别来自酸橙（叶肉亲本）和澳洲指橘（悬浮亲本）；在丹西红橘＋长寿金柑属间组合中，分析的两棵植株都是异源四倍体体细胞杂种，其核来源于双亲，线粒体ＤＮＡ主要来源于丹西红橘（悬浮亲本），也有部分丢失，叶绿体ＤＮＡ则来源于丹西红橘；在沙漠蒂甜橙＋酸橙种间组合中，分析的５棵植株都是异源四倍体体细胞杂种，其核来源于双亲，其胞质ＤＮＡ来源于沙漠蒂甜橙（悬浮亲本）；在丹西红橘＋红江橙种问组合中，分析的两棵植株中一棵为二倍体非对称体细胞杂种，其核ＤＮＡ具有双亲的部分ＤＮＡ，并有重组发生，胞质ＤＮＡ则来源于红江橙（叶肉亲本）；而另一棵则是异源四倍体体细胞杂种，其核ＤＮＡ来源于双亲，并有重组发生，胞质ＤＮＡ则来源于红江橙。

关键词：柑橘，胞质体，“胞质体．原生质体”融合，非对称融合，体细胞杂种，ＳＳＲ，ＦＣＭ，ＣＡＰＳ，ＳＲＡＰ，ＩＩＶＶ

ＳＴＵＤＩＥＳＯＮＰＲＯＴｏＰＬＡＳＴＦＵＳＩｏＮＡＮＤ

ＩＮＨＥＲＩＴＡＮＣＥＯＦＮＵＣＬＥＡＲＡＮＤＣＹＴｏＰＬＡＳＭＩＣＣｏＭＰＯＮＥＮＴＳＯＦＳＯＭＡＴＩＣＨＹＢＲＩＤＳＩＮＣＩＴＲＵＳ

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