第32卷第3期东 北 林 业 大 学 学 报

Vol.32No.3喜树叶片硝酸还原酶活性的测定方法

孙世芹 阎秀峰

(东北林业大学,哈尔滨,150040)

1)

摘 要 以喜树(Camptothecaacuminata)为材料,探讨了用体内法测定其叶片硝酸还原酶活性的若干问题,比较分析了硝酸盐诱导、2,4-二硝基苯酚、三氯乙酸及煮沸等因素对硝酸还原酶活性测定结果的影响,以寻求体内法测定喜树叶片硝酸还原酶活性的最佳条件。试验表明,体内法是一种操作简便、准确可靠的测定喜树叶片硝酸还原酶活性的方法,为进一步研究喜树的氮代谢奠定了基础。

关键词 喜树;硝酸还原酶;体内法分类号 S792.99;Q946.5

DeterminationMethodofNitrateReductaseActivityintheLeavesofCamptothecaacuminata/SunShiqin,YanXiufeng(NortheastForestryUniversity,Harbin150040,P.R.China)//JournalofNortheastForestryUniversity.-2004,32(3).-83~84

ByusingCamptothecaacuminataasexperimentalmaterials,thedeterminationofthenitratereductaseactivity(NRA)intheleavesofCamptothecaacuminatawasdiscussedbyinvivomethod.Theeffectsofseveralmainfactorsofinvivomethodsuchasnitrateinduction,2,4-dinitrophenol(DNP),trichloroaceticacid(TCA)andboilingetc.onthedeterminationoftheNRAwerecomparedandanalyzed.Themodifiedinvivomethod,whichisreliableandeasytobemanipulated,isfeasibletodeterminetheNRAintheleavesofC.acuminata.

Keywords Camptothecaacuminata;Nitratereductase;Invivomethod 植物所需的全部营养中,氮素是影响其生长发育最关键、最活跃的元素。植物能吸收三种不同形式的氮源:硝酸盐、氨和氨基酸[1]。硝酸盐是植物吸收的主要氮素形态。外界的硝态氮进入植物体内必须首先同化成氨,然后结合到一个碳骨架上,形成氨基酸和酰胺,才能参与蛋白质、核酸和含氮次生

[2~4]

代谢物的生物合成,以供生长代谢需要,植物硝酸还原酶(NR,nitratereductase,EC1.6.6.1)就是硝态氮同化的关键

+

酶和限速酶[5,6],它催化的反应如下:NO-3+NAD(P)H+H+ NO-2+NAD(P)+H2O。硝酸还原酶活性(NRA)高低

不仅表明了植物体内硝酸盐的吸收、积累水平,也反映着植物对氮素的利用水平,在植物氮代谢的研究中,硝酸还原酶活性是研究重点之一。

目前,报道硝酸还原酶活性的测定方法主要有体外法[5]

和体内法[7],又分别称为离体法和活体法。体外法操作手续繁杂、要求条件较高;体内法简便、快速,采用渐多。但有报道认为[7],体内法存在NRA测定值偏低、重复性不够理想的缺点,因而需要针对不同的测定材料,对体内法做进一步的探讨,确定最佳的测定条件。但有关喜树氮代谢中硝酸还原酶活性测定的方法还未见报道。为此笔者将探讨用体内法测定喜树叶片硝酸还原酶活性的最佳条件,为进一步研究喜树的氮素代谢奠定基础。

1.1 试验材料的KNO3诱导处理

硝酸还原酶是一种底物诱导酶,有文献报道[8],KNO3溶液诱导可以提高材料中的硝酸还原酶活性。为此,笔者进行了KNO3溶液诱导处理实验。将喜树幼苗根系小心用蒸馏水洗净后,移入50mmol/LKNO3的溶液中进行诱导处理,处理时间为24h和48h,并与未进行诱导处理的幼苗进行比较。1.2 硝酸还原酶活性测定

参照周树等[7]、张志良[9]的体内测定法,测定喜树幼苗叶片的硝酸还原酶活性。

从喜树幼苗上取下叶片,用蒸馏水洗净,吸干。用直径为0.75cm的打孔器打成多个圆片。随机取30片叶圆片准确称重后置于50mL烧杯中,加入10mL含100mmol/LKNO3的磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH=7.5),空白实验的磷酸缓冲液中不含KNO3。将烧杯放入真空干燥器中抽气,反复数次,使叶片完全沉于液面下。取出烧杯置于30 下暗保温30min。保温结束后取1mL反应液,加入2mL1%磺胺溶液、2mL0.2%1-萘胺溶液,30 下静放30min,用BeckmanUV-75型分光光度于520nm波长下比色。NRA以每克鲜重材料每小时催化生成NO-2的微摩尔数表示。

在上述基本流程基础上,做以下各处理。

(1)2,4-二硝基苯酚(DNP)处理:笔者根据加入DNP能够提高NRA测定值的报道[7],分别在抽气前和抽气后向烧杯中加入1mL1mmol/L的DNP,以阻止NO-2被进一步还

原,比较抽气前和抽气后加入DNP对NRA的影响;

(2)蔗糖处理:在抽气前向烧杯中加1mL2.5mmol/L的蔗糖溶液,为硝酸还原酶的诱导合成提供能量;

(3)三氯乙酸(TCA)处理:暗保温结束后,加入0.51mL三氯乙酸(1%),使酶钝化;

(4)暗保温处理:分别保温10、20、30、40min;(5)煮沸处理:为使暗保温产生的NO-2彻底从叶片组织

,min5、8、14

1 材料和方法

以一年生喜树幼苗为材料,摘取全株成熟叶片测定

NRA,每个处理重复3次。

1)国家自然科学基金(30070086)和黑龙江省杰出青年基金(JC-02-11)资助项目。

第一作者简介:孙世芹,女,1970年6月生,东北林业大学生命科学学院,博士研究生。

收稿日期:2003年9月17日。责任编辑:张建华。

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min,并与未煮沸的进行比较。

2 结果与分析

2.1 硝酸盐诱导对NRA的影响

从图1可以看出,经过诱导的喜树幼苗,叶片中NRA明显高于未经诱导处理的,但诱导24h和48h的NRA差异不显著。一般情况下,用50mmol/L的KNO3溶液对喜树幼苗诱导24h即可得到较好的结果,可以提高NRA的测定值及

试验的重现性和可比性。

图2 暗保温时间对喜树叶片中NRA的影响

2.6 煮沸时间对NRA的影响

从图3可以看出,煮沸处理能显著地提高喜树叶片的NRA,且随着煮沸时间的延长,NRA也逐渐增高,煮沸11min时NRA最高,继续煮沸,NRA则无明显变化。这说明煮沸处理可以使在暗保温过程中产生的NO-2更彻底地从叶片组织

[7]

中渗出来。有关研究也认为,体内法测定NRA的数据稳定性与NO-NO-3能否充分进入叶片、2是否充分渗出有一定

的相关性。因而测定喜树幼苗叶片的NRA时,在暗保温结束后进行煮沸处理是十

分必要的。

图1 诱导时间对喜树叶片中NRA的影响

注:数据为平均值!标准误(n=3),误差线上相同字母表示差异不显著(p=0.05)。

2.2 DNP处理对NRA的影响

比较表1中A和B的数据可以看出,在抽气前加入DNP比抽气后加入的NRA高,二者差异显著。出现这种结果的

-原因可能在于:抽气前加入DNP阻止了反应液内的NO2在抽气过程中被亚硝酸还原酶进一步还原。因此,在抽气前加入DNP,比较有利于NRA的测定。

表1 不同处理方法对喜树叶片中NRA的影响

处理ABCD

蔗糖++-+

+-++

DNP抽气前

抽气后-+--TCA+++-煮沸10min++++

NRA/ mol h-1 g-1(1.040!0.03)a(0.821!0.05)b(0.841!0.07)b(1.033!0.04)a

图3 煮沸时间对喜树叶片中NRA的影响

3 结论

用体内法测定喜树叶片NRA时,一般情况下首先要将材料用50mmol/L的KNO3溶液诱导24h,在抽气前加入适量的DNP及蔗糖溶液。暗保温结束后,需要煮沸11min以上。该方法操作相对简便、重复性较好。

参 考 文 献

1 LambersH,ChapinFS,PonsTL.Plantphysiologicalecology.

NewYork:Springer-VerlagNewYorkInc,1998.252~253

2 LarcherW.PhysiologicalPlantEcology.ThirdEdition.NewYork:

Springer,1995.190~191

3 TischnerR.Nitrateuptakeandreductioninhigherandlowerplants.

Plant,Cell&Environment,2000,23(10):1005~1024

4 RitsukoI,KumabK,MiyatabT,etal.Nitrogen-assimilatingen

zymesinlandplantsandalgae:phylogenicandphysiologicalperspec tives.PhysiologiaPlantarum,2002,116(1):1~11

5 陈微,张德颐.植物组织中硝酸还原酶的提取测定和纯化.植物生

理学通讯,1980(4):45~49

6 CampbellWH.Nitratereductaseanditsroleinnitrateassimilationin

plants.PhysiolPlant,1988(74):214~219

7 周树,郑相穆.硝酸还原酶体内分析方法的探讨.植物生理学通讯,

1985(1):47~49

8 周国章,苏梦云.杉木硝酸还原酶的初步研究.林业科学,1998,24

(2):156~161

9 张志良.植物生理学实验指导.第2版.北京:高等教育出版社,

1990.65~68

注:NRA数据为平均值!标准误(n=3);具有相同字母者表示差异不显著(p=0.05)。

2.3 蔗糖处理对NRA的影响

比较表1中A和C的数据还可以看出,加入蔗糖的比未加的NRA高,二者差异显著。有报道认为[8],加入的蔗糖可能为硝酸盐同化提供更多的还原力,以保证反应体系所需要的能量。

2.4 三氯乙酸处理对NRA的影响

将表1中A和D两数据相比较可以看出,是否加入TCA对NRA的测定结果几乎没有影响。TCA的作用在于使酶钝化而终止反应,但随后的煮沸不仅使NO-2从叶圆片中渗出,

也使所有蛋白质彻底失活,这可能掩盖了加入TCA的作用。2.5 暗保温时间对NRA的影响

从图2可以看出,在30min以内,NRA与暗保温时间几乎呈线性关系,超过30min则NRA趋于平稳。周树等报道了NRA在暗保温30~40min内的变化,35min时NRA最高,40min时略有下降[7]。从本实验的结果看,对于喜树幼苗叶片的NRA测定,选择30min

的暗保温时间比较适合。