实验25 氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶活力

氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶活力

一、原理

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下列反应：

本反应产物H2 O2 可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料

水稻或小麦叶片。

（二）仪器设备

高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为4000lx），试管或指形管数支。

（三）试剂

（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。

（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液 称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。

（3）750µmol/L氮蓝四唑溶液 称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（4）100µmol/L EDTA-Na2溶液 称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。

（5）20 µmol/L核黄素溶液 称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。

三、实验步骤

1、酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5－2ml于4000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。

2、显色反应 取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下表加入各种溶液：

混匀后将1支对照管置暗处，其他各管于4000lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，

温度高，时间缩短，低时延长）。

3、SOD活性测定

至反应结束后，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管的吸光度。

四、结果计算

已知SOD活性单位以抑制NBT光还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。

SOD总活性＝(ACK AE) V ACK W Vt2

式中：SOD总活性以每克样品鲜质量的酶单位表示（U/g）；Ack 为照光对照管的吸光度；AE 为样品管的吸光度；V为样品液总体积(ml);Vt 为测定时样品用量(ml)；W为样鲜重(g)。