光暗条件下大蒜DNA甲基化差异的初步研究_何艳霞(2)

86植物生理学通讯　　第４３卷　第１期，２００７年２月

表１　　实验的引物序列

Ｔａｂｌｅ　１　　Ｔｏｔａｌ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ

　　　　　　　　　　引物Ｅ－Ａ＊

Ｈｐａ－ｍｓｐ＊Ｅ－ＡＡＣＥ－ＡＡＧＥ－ＡＣＡＥ－ＡＣＴＥ－ＡＣＣＥ－ＡＣＧＥ－ＡＧＣＥ－ＡＧＧ

Ｈｐａ－Ｍｓｐ－ＴＣＡＡ

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　序列（５＇→3＇）ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡＴＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＧＧＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡＣＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＧＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＧＣＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＧＧＴＣＡＡ

别编为１号、２号、３号和４号材料，即重复４次。从每个重复的材料中，分别取１０个大小基本一致的蒜瓣均分为２部分，取相同的玻璃杯（２００　ｍＬ），盛装等量的自来水，用滤纸制成滤纸桥，滤纸桥中间打一小孔，以便大蒜根生长。将滤纸桥放入水杯，并接触水面，实验材料置于滤纸桥上，使其生根部分与水面接触。材料都放在２３　℃恒温培养室中培养，一部分于光照下培养，光照强度为１１　µmｏｌ·m－２·s－１，每天光照１２　ｈ，另一部分于暗箱中遮光培养。

ＭＳＡＰ分析以ＡＦＬＰ实验为基础，实验流程参照Ｘｉｏｎｇ等（１９９９）和Ｃｅｒｖｅｒａ等（２００２）的方法。模板ＤＮＡ分别用ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩＩ和ＥｃｏＲＩ／ＭｓｐＩ进行酶切。ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩＩ酶切分步进行，２０　ｍＬ体系含２５０　ｎｇ　ＤＮＡ，ＥｃｏＲＩ　３　Ｕ，１０倍缓冲液（５００ｍｍｏｌ·L－１　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ　７．５；１００　ｍｍｏｌ·L－１　ＭｇＣｌ２；１０　ｍｍｏｌ·L－１　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ；１００　ｍｍｏｌ·L－１　ＮａＣｌ）和无菌水，于３７　℃下温浴２￣４　ｈ，加２倍体积无水乙醇后于－２０　℃下放２　ｈ，抽干加６　ｍＬ无菌水溶解，然后加入３　Ｕ　ＨｐａＩＩ，２　ｍＬ　１０倍缓冲液（１００ｍｍｏｌ·L－１　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ　７．５；１００　ｍｍｏｌ·L－１　ＭｇＣｌ２；１０　ｍｍｏｌ·L－１　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ），用水补足到２０　ｍＬ，３７　℃下酶切３　ｈ；ＥｃｏＲＩ／ＭｓｐＩ酶切体系同前，只是加入ＥｃｏＲＩ和ＭｓｐＩ　这２种酶后同时反应，在３７℃下放３　ｈ。酶切产物分别都加上ＥｃｏＲＩ接头和ＨｐａＩＩ－ＭｓｐＩ接头，ＥｃｏＲＩ接头序列是５＇－ＣＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣ－３＇，３＇－ＣＴＧＡＣＧＣＡＴ－ＧＧＴＴＡＡ－５＇，ＨｐａＩＩ－ＭｓｐＩ接头序列是５＇－ＧＡＴＣ－ＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＣＴ－３＇，３＇－ＡＧＴＡＣＴＣＡＧＧＡＣＧＡ－ＧＣ－５＇，于２５　℃下连接２　ｈ；以稀释５倍的连接产物进行预扩增反应，预扩增产物稀释２０倍后再进行选择性扩增反应。所有的引物序列见表１，预扩增和选择性扩增程序参照邹喻苹等（２００１）书中的程序，扩增产物加入１／２体积的变性缓冲液（见分子克隆第三版），放入９４　℃水浴３　ｍｉｎ后立即转入０　℃中，进行６％的变性聚丙烯酰胺电泳，条件为５５　Ｗ，２．５　ｈ，最后银染显色。

　　＊为预扩增引物，其余的为选择性扩增引物。

黄），苗高而纤细；光照条件下正常生长的大蒜为绿色，蒜苗粗壮而矮一些（图略）。２　　ＤＮＡ甲基化水平变化

光暗条件下生长的大蒜ＤＮＡ分别进行ＭＳＡＰ分析，观察到３种带型：Ｉ型带是在ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩＩ和ＥｃｏＲＩ／ＭｓｐＩ这２种酶切组合中均出现的带；ＩＩ型带是在ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩＩ酶切中出现但在ＥｃｏＲＩ／ＭｓｐＩ酶切中不出现的带；在ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩＩ酶切中不出现但在ＥｃｏＲＩ／ＭｓｐＩ中出现的带为ＩＩＩ型带（图１）。用８对引物组合进行扩增，共得到３４３条清晰的条带，所有的带型统计见表２。在光照和黑暗２种条件下生长的样品，完全一致的条带有２４０条，其中最多的带型是Ｉ型带，有１６５条；而ＩＩ型和ＩＩＩ型带相对较少，ＩＩ型带有３４条，ＩＩＩ型带有４１条。样品间不一致的ＤＮＡ条带共有１０３条，其中光照与非光照处理样品之间有差异的条带有４７条。在这些差异带中，光照处理的样品与黑暗处理的相比较，去甲基化位点２８个（标＊的带）。有１９条带无法确定是去甲基化还是新产生的甲基化（标＊＊的带），这４７条差异带在所有黑暗或光照条件下的样品都是一致的（即要么是所有光下的样品有，要么是所有暗下的样品有），由于样品的其他生长条件完全相同，因此这些差异应该与光照与否有关。其中光照条件下特有的带有２５ …… 此处隐藏：49字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……