光暗条件下大蒜DNA甲基化差异的初步研究_何艳霞(2)

时间:2025-07-11

86植物生理学通讯  第43卷 第1期,2007年2月

表1  实验的引物序列

Table 1  Total numbers of amplified fragments

          引物E-A*

Hpa-msp*E-AACE-AAGE-ACAE-ACTE-ACCE-ACGE-AGCE-AGG

Hpa-Msp-TCAA

                   序列(5'→3')GACTGCGTACCAATTCAATCATGAGTCCTGCTCGGGACTGCGTACCAATTCAACGACTGCGTACCAATTCAAGGACTGCGTACCAATTCACAGACTGCGTACCAATTCACTGACTGCGTACCAATTCACCGACTGCGTACCAATTCACGGACTGCGTACCAATTCAGCGACTGCGTACCAATTCAGGATCATGAGTCCTGCTCGGTCAA

别编为1号、2号、3号和4号材料,即重复4次。从每个重复的材料中,分别取10个大小基本一致的蒜瓣均分为2部分,取相同的玻璃杯(200 mL),盛装等量的自来水,用滤纸制成滤纸桥,滤纸桥中间打一小孔,以便大蒜根生长。将滤纸桥放入水杯,并接触水面,实验材料置于滤纸桥上,使其生根部分与水面接触。材料都放在23 ℃恒温培养室中培养,一部分于光照下培养,光照强度为11 µmol·m-2·s-1,每天光照12 h,另一部分于暗箱中遮光培养。

MSAP分析以AFLP实验为基础,实验流程参照Xiong等(1999)和Cervera等(2002)的方法。模板DNA分别用EcoRI/HpaII和EcoRI/MspI进行酶切。EcoRI/HpaII酶切分步进行,20 mL体系含250 ng DNA,EcoRI 3 U,10倍缓冲液(500mmol·L-1 Tris-HCl,pH 7.5;100 mmol·L-1 MgCl2;10 mmol·L-1 dithiothreitol;100 mmol·L-1 NaCl)和无菌水,于37 ℃下温浴2 ̄4 h,加2倍体积无水乙醇后于-20 ℃下放2 h,抽干加6 mL无菌水溶解,然后加入3 U HpaII,2 mL 10倍缓冲液(100mmol·L-1 Tris-HCl,pH 7.5;100 mmol·L-1 MgCl2;10 mmol·L-1 dithiothreitol),用水补足到20 mL,37 ℃下酶切3 h;EcoRI/MspI酶切体系同前,只是加入EcoRI和MspI 这2种酶后同时反应,在37℃下放3 h。酶切产物分别都加上EcoRI接头和HpaII-MspI接头,EcoRI接头序列是5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3',3'-CTGACGCAT-GGTTAA-5',HpaII-MspI接头序列是5'-GATC-ATGAGTCCTGCT-3',3'-AGTACTCAGGACGA-GC-5',于25 ℃下连接2 h;以稀释5倍的连接产物进行预扩增反应,预扩增产物稀释20倍后再进行选择性扩增反应。所有的引物序列见表1,预扩增和选择性扩增程序参照邹喻苹等(2001)书中的程序,扩增产物加入1/2体积的变性缓冲液(见分子克隆第三版),放入94 ℃水浴3 min后立即转入0 ℃中,进行6%的变性聚丙烯酰胺电泳,条件为55 W,2.5 h,最后银染显色。

  *为预扩增引物,其余的为选择性扩增引物。

黄),苗高而纤细;光照条件下正常生长的大蒜为绿色,蒜苗粗壮而矮一些(图略)。2  DNA甲基化水平变化

光暗条件下生长的大蒜DNA分别进行MSAP分析,观察到3种带型:I型带是在EcoRI/HpaII和EcoRI/MspI这2种酶切组合中均出现的带;II型带是在EcoRI/HpaII酶切中出现但在EcoRI/MspI酶切中不出现的带;在EcoRI/HpaII酶切中不出现但在EcoRI/MspI中出现的带为III型带(图1)。用8对引物组合进行扩增,共得到343条清晰的条带,所有的带型统计见表2。在光照和黑暗2种条件下生长的样品,完全一致的条带有240条,其中最多的带型是I型带,有165条;而II型和III型带相对较少,II型带有34条,III型带有41条。样品间不一致的DNA条带共有103条,其中光照与非光照处理样品之间有差异的条带有47条。在这些差异带中,光照处理的样品与黑暗处理的相比较,去甲基化位点28个(标*的带)。有19条带无法确定是去甲基化还是新产生的甲基化(标**的带),这47条差异带在所有黑暗或光照条件下的样品都是一致的(即要么是所有光下的样品有,要么是所有暗下的样品有),由于样品的其他生长条件完全相同,因此这些差异应该与光照与否有关。其中光照条件下特有的带有25 …… 此处隐藏:49字,全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……

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