细胞工程在环境保护方面的应用

制作人：吕敏

一、细胞工程概论 细胞工程是即在细胞水平上应用细胞生物学和分 子生物学等学科的理论和技术，按照人们的要求, 有计划地大规模培养组织和 细胞以 获得生物极其 制品，或以改变细胞的遗传组织或以生产新的品 种的工程。

细胞工程主要研究的是细胞的

细胞衰老和凋亡

细胞分化就是由一种相同的细胞类型经过细 胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳 定性差异，产生不同的细胞类群的过程。

(1)细胞增殖是生物繁殖的基础 单细胞生物以细胞分裂的方式产生后 代；多细胞生物的繁殖和发育的基础。

细胞衰老的特征：细胞内水分减少，细胞萎缩，细胞体积变小 有些酶活性降低 细胞内色素沉积 细胞内线粒体数量减少呼吸速率减慢，细胞核增大， 染色体固缩，染色加深 细胞膜通透性功能改变，物质运输故能降低。

细胞的凋亡 定义：有基因所决定的细胞自动结束生命的生理过程。受到严格的由遗 传机制决定的程序性过程。受到严格的由遗传机制决定的程序性调控， 也常常被称为细胞编程性死亡。 实质：与凋亡相关的基因选择性表达式细胞凋亡

一 种 细胞凋亡的意义： 正 常 细胞的自然更新，消除不必要的细胞，而 的 生 不引起炎症。 理 多细胞生物正常发育，维持内部环境稳定， 过 程 抵御外界各种因素的干扰

细胞工程的主要技术和应用包括组织和细 胞的培养技术，细胞的融合技术，细胞器 移植技术,体外受精技术，物理、化学技术 等。目前在 环境治理中应用较多的是细胞 培养技术，细胞的融合技术及物理、化学 技术。

(一)细胞培养技术 (二)细胞融合技术 1、遗传标记的筛选 2、原生质体制备与再生 3、原生质体融合 4、融合子的鉴定 (三)固定化细胞技术

(一)细胞培养技术 细胞培养技术包括微生物的培养、植物细胞培养以及动物 的组织与细胞培养。 微生物的培养主要是指微生物营养结构的研究以及培养方 法的研究，其目的是提供用于研究或生产的微生物菌种。 植物细胞培养包括植物器官、组织、细胞、原生质体、胚 和植株的培养。它是在植物组织技术基础上发展起来的， 是指在立体条件下培养植物细胞的方法。 动物细胞培养是在动物体内获取某些器官或组织的细胞， 在模拟体内生理条件下，进行离体培养。常用的方法有微 导管培养法、微载体培养法和微胶囊培养法。

(二)细胞融合技术 细胞融合是指两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞， 使一个细胞的遗传物质包括细胞核DNA和核外基

因都进入 另一个细胞。 它是继转化、转导和接合之后一种更有效转移遗传物质的 手段。细胞融合技术能克服遗传障碍，实现远缘杂交；构 建集双亲优良遗传性状于一体的融合子，创造有应用前景 的生物。其整个过程包括：遗传标记筛选、原生质体的制 备、融合与再生、融合子的鉴定。

1、遗传标记的筛选 融合子的筛选是融合过程的关键。目前采用的亲 本遗传标记和筛选主要有下列几种方法： (1)营养缺陷型标记 (2)抗药性标记 (3)荧光色素标记 (4)失活原生质体供体法

原生质体制备与再生

(1)制备 根据细胞壁的不同结构与组成，菌体的处理方法不同。 a、在制备细菌、放线菌的原生质体时，主要使用溶菌酶， 其中革兰氏阳性菌用溶菌酶处理，革兰氏阴性菌用溶菌酶 加乙二胺四乙酸处理。 b、对于酵母、霉菌、大型真菌、植物，由于其细胞壁组 成更为复杂，常用纤维素酶、蜗牛酶、几丁质酶等复合酶 处理、 原生质体的制备过程中受影响的因素主要有培养基成分、 培养方法、菌龄、酶浓度、酶处理温度与时间、pH值、渗 透压稳定剂等。

原生质体制备与再生

制备的原生质体已经失去细胞壁，仅有一层厚约10nm的细 胞膜，它具有生物活性，但不是正常的细胞，在普通培养 基上不能生长，必须涂布与再生培养基上，使之再生为正 常的细胞。 再生培养基需补加两类物质： 一类是蛋白质、糖类或氨基酸等营养因子； 另一类是渗透压稳定剂，如蔗糖、丁二酸钠、KCl、Mg2+等。

(3)原生质体融合

1974年，匈牙利的Ferenczy采用离心力诱导的方法报道了 白地酶的营养缺陷型突变株的原生质体的融合。随后人们 相继用NaCl、KCl和Ca(NO3)2等作为诱变剂进行融合，但 融合频率都很低。同年，Kao发现PEG在适量Ca2+存在下能 有效地诱导植物原生质体融合，从而是这一技术跃上了新 的阶段。大大提高了融合频率。PEC多采用分子量4000和 6000两种，Hopwood研究认为这两者融合的效果差别不大。 融合率还受PEG和阳离子的浓度、诱导融合时间、pH值等 因素的影响。林红雨等采用在融合液中添加新生磷酸钙的 方法可以促进原生体融合。在融合方法上，除了化学因子 诱导融合外，电场诱导、激光诱导细胞融合的新技术，进 一步提高了融合频率。

4、融合子的鉴定

在再生培养基上再生出的标记得到互补的菌落，我们 可以初步判定它是融合子。由于这样检出的融合子中，还 有部分杂合子、部分二倍体、异合体的存在，所以要对检 出的融合子做进一步的鉴定。 鉴定工作一般从形态学、生理生化性

质、生物量、遗 传学(基因型、DNA含量、GC比值)和同工酶等几个方面 进行。近年来，又有人通过DNA限制性内切酶切片段的 比较、核苷酸序列分析、分子杂交RAPD技术等分子生物学 方法来鉴定融合子。

到目前为止，虽然关于融合子中双亲株遗传物质重组 的分子机制还不很明确，但有些问题人们已形成共识：原 生质体融合后的细胞处于暂时的二倍体(或多倍体)状态， 之后有两种可能：一是染色体DNA不发生重组，两个细 胞的染色体共存于1个细胞内，形成异核体，这是不稳定 的融合子；另一类是两亲株的整套基因组(包括细胞核、 细胞质)相互接触，染色体DNA发生多位点交换产生真 正的同源重组，从而产生各种各样的基因重组，获得多种 类型的重组子，通过连续传代分离纯化可以将这两类融合 区分开。另外，融合后染色体的重组是随机的种属间细胞 对异源DNA的限制作用及染色体DNA的非同源性，仍是融 合的一大障碍。

(三)固定化细胞技术

固定化细胞技术(简称IMC),也叫固定化微生物技 术，是指通过化学或物理手段，将筛选分离出的是易于降 解特定废水的高效菌株，或通过基因工程技术克隆的特异 性菌株进行固定化、使其保持活性并反复利用。固定化细 胞有细胞密度高、反应速度快、耐毒害能力强、产物分离 容易、运转费用低、维护管理简单和剩余污泥少等优点， 因此，固定化细胞技术已越来越受到人们的重视。

固定化细胞的制备方法按照固定载体与作用方式不同

01

吸附法

02

包埋法

03

交联法

吸附法(载体结合法) 通过物理吸附、化学 或离子结合的方法，将细 胞固定在非水溶性载体上。 该方法操作简单，细胞活 性损失小，载体可反复使 用，但所用固定的细胞数 量有限，细胞和载体结合 不牢，易脱落。废水处理 中的生物膜法是其代表性 例子。

包埋法 使细胞扩散进入多孔性载体内部或浆细胞包裹在凝胶 网格结构中或半透性聚合薄膜内，小分子的底物和产物可 以自由扩散，而细胞却不会扩散到周围介质中去。该法操 作简单，对细胞活性影响小，制作的固定化细胞球强度高， 是目前研究最广泛的固定化方法，但包埋材料会一定程度 阻碍底物和氧扩散，并对大分子底物不适用。