生物技术制药36讲

第九节 基因工程药物的 质量控制是利用活细胞作为表达系统，产 是利用活细胞作为表达系统， 物的分子量较大， 物的分子量较大，并有复杂的结 还参与生理功能的调节， 构，还参与生理功能的调节，用 量极微， 量极微，任何质和量的偏差都可 贻误病情造成严重危害。 贻误病情造成严重危害。

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宿主细胞中表达的外源基因， 宿主细胞中表达的外源基因， 在转录翻译精制工艺放大过程 中都可能发生变化， 中都可能发生变化，故从原料 以及制备全过程都必须严格控 制条件和鉴定质量。 制条件和鉴定质量。

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一、 原材料的质量控制原材料的质量控制是确保编码 药品的DNA序列的正确性 序列的正确性， 药品的DNA序列的正确性，重组微 生物来自单一克隆，所用质粒纯而 生物来自单一克隆， 稳定， 稳定，以保证产品质量的安全性和 一致性。 一致性。

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根据质量控制要求应了解以下 特性： 特性： 明确目的基因的来源、克隆经过， ⒈明确目的基因的来源、克隆经过， 并以限制性内切酶酶切图谱 和核苷酸序列予以确证； 和核苷酸序列予以确证；

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⒉应提供表达载体的名称、结构、遗 应提供表达载体的名称、结构、 传特性及各组成部分(如复制子、 传特性及各组成部分(如复制子、 启动子)的来源与功能， 启动子)的来源与功能，构建中所 用位点的酶切图谱， 用位点的酶切图谱，抗生素抗性标 记物； 记物； 应提供宿主细胞的名称、来源、 ⒊ 应提供宿主细胞的名称、来源、 传代历史、 传代历史、检定结果及其生物学特 性；

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⒋须阐明载体引入宿主细胞的方法 及载体在宿主细胞与载体结合后的 遗传稳定性； 遗传稳定性； ⒌提供插入基因与表达载体两侧端 控制区内的核苷酸序列，详细叙述 控制区内的核苷酸序列， 在生产过程中启动与控制基因在宿 主细胞中表达的方法及水平等。 主细胞中表达的方法及水平等。

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二、培养过程的质量控制在工程菌的贮存中， 在工程菌的贮存中，要求种子 克隆纯而稳定； 克隆纯而稳定； 在培养过程中， 在培养过程中，要求工程菌所 含的质粒稳定，始终无突变； 含的质粒稳定，始终无突变； 在重复生产发酵中， 在重复生产发酵中，工程菌表 达稳定； 达稳定； 始终能排除外源微生物污染。 始终能排除外源微生物污染。

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生产基因工程产品应有种子 批系统， 批系统，并证明种子批不含有致 癌因子，无细菌、病毒、 癌因子，无细菌、病毒、真菌和 支原体等污染， 支原体等污染，并由原始种子批 建立生产用工作细胞库。 建立生产用工作细胞库。

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原始种子批须确证克隆基因 DNA序列

详细叙述种子批来源、 序列， DNA序列，详细叙述种子批来源、 方式、保存及预计使用期， 方式、保存及预计使用期，保存 与复苏时宿主载体表达系统的稳 定性。 定性。

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对生产种子，应详细叙述细 对生产种子， 胞生长与产品生成的方法和材料， 胞生长与产品生成的方法和材料， 并控制微生物污染； 并控制微生物污染；提供培养生 产浓度与产量恒定性数据， 产浓度与产量恒定性数据，依据 宿主细胞-载体系统稳定性， 宿主细胞-载体系统稳定性，确定 最高允许传种代数； 最高允许传种代数；

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在培养过程中，应测定被表 在培养过程中， 达基因分子的完整性及宿主细 胞长期培养后的基因型特征； 胞长期培养后的基因型特征； 依宿主细胞依宿主细胞-载体稳定性与产品 恒定性，规定持续培养时间， 恒定性，规定持续培养时间， 并定期评价细胞系统和产品。 并定期评价细胞系统和产品。

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培养周期结束时，应监测 培养周期结束时， 宿主细胞-载体系统的特性， 宿主细胞-载体系统的特性， 如质粒拷贝数、 如质粒拷贝数、宿主细胞中表 达载体存留程度， 达载体存留程度，含插入基因 载体的酶切图谱等。 载体的酶切图谱等。

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三、纯化工艺过程的质量控制产品要有足够的生理和生 物学试验数据，确证提纯物分 物学试验数据， 子批间保持一致性； 子批间保持一致性；外源蛋白 DNA与热源质控制在规定 质、DNA与热源质控制在规定 限度以下。 限度以下。

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在精制过程中能清除宿主 细胞蛋白质、核酸、糖类、 细胞蛋白质、核酸、糖类、病 毒、培养基成分及精制工序本 身引入的化学物质， 身引入的化学物质，并有检测 方法。 方法。

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四、目标产品的质量控制基因工程药物的质量控制主要 包括以下几项要求:产品的鉴别、 包括以下几项要求:产品的鉴别、纯 活性、安全性、 度、活性、安全性、稳定性和一致 它需要利用生物化学、免疫学、 性。它需要利用生物化学、免疫学、 微生物学、 微生物学、细胞生物学和分子生物 学等多学科的理论与技术所建立的 鉴定方法。 鉴定方法。

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⒈产品的鉴别常用的鉴定方法: 常用的鉴定方法: 电泳方法: SDS-PAGE、等电聚焦、 电泳方法: SDS-PAGE、等电聚焦、 免疫电泳 免疫学方法: 放射免疫(RIA)、 免疫学方法: 放射免疫(RIA)、酶联 免疫(ELISA) 免疫(ELISA) 受体结合试验 高效液相色谱(HPLC)、肽图分析法、 高效液相色谱(HPLC)、肽图分析法、 圆二色谱、 末端序列分 析、圆二色谱、核磁 共振

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⑴ 肽图分析 肽图分析是用酶法或化学法降解 目的蛋白质, 目的蛋白质,对生成的肽段进行分离分 析。它是检测蛋白

质一级结构最有效 的方法， 的方法，该技术灵敏高效是对基因工 程药物的分子结构和遗传稳定性进行 评价和验证的首选方法。常用HPLC、 评价和验证的首选方法。常用HPLC、 毛细管电泳。 毛细管电泳。

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⑵ 氨基酸成分分析 50个氨基酸较理想 50个氨基酸较理想 ⑶ 部分氨基酸序列分析 N端15个氨基酸可作为重 15个氨基酸可作为重 组蛋白质和多肽的重要鉴 定指标。 定指标。

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⑷ 重组蛋白质浓度测定和相对分 子量的测定 蛋白质浓度测定方法有:福林蛋白质浓度测定方法有:福林-酚 法、双缩脲法 蛋白相对分子量的测定: 蛋白相对分子量的测定:凝胶过滤 SD-SPAGE法 法、SD-SPAGE法